Новые осложнения возникли в связи с Реформацией, ее идеи стали распространяться в Ливонии с 20-х годов XVI в., особенно в городах. В отношении причин и предпосылок Реформации Прибалтика имела много общего с другими регионами. Немецкие бюргеры ливонских городов с энтузиазмом восприняли идеи Реформации от бюргеров Германии, близких им по языку, культуре, ментальности и интересам. Для городских «не немцев» Реформация, напротив, стала орудием борьбы за права и лучшую долю, против патрициев — консервативных католиков. Для городских властей и бюргеров Реформация была орудием борьбы за независимость от католических олигархов — архиепископа и орденских верхов. Магнаты и вообще землевладельцы были заинтересованы в секуляризации и разделе церковной собственности. Крестьяне надеялись на послабления в отношении церковных поборов, на установление справедливых порядков. Предпосылкой Реформации стало и развитие национального и регионального самосознания, языков и письменности. Реформаторы довели до практического завершения дело, которое начали еще позднесредневековые католики: религиозное просвещение на языках национальной окраины, к которой тогда относилась и Прибалтика.
Реформация распространилась в Ливонии преимущественно в форме лютеранства. Власти городов вскоре поддержали лютеран, стали назначать их на церковные должности. Тем временем в городах появились и анабаптисты. Самым выдающимся из них был странствующий ремесленник Мельхиор Гофман, возглавивший анабаптистское движение в Прибалтике, Скандинавии, а после и в Германии. Следствием его проповедей стали волнения в Риге, Ревеле и Дерпте: горожане громили церкви, уничтожали иконы. Начались и крестьянские восстания.
Вскоре идеи Реформации обрели поддержку светской элиты. Многие рыцари стали принимать лютеранство и записывать в него своих крестьян. Около середины XVI в. большинство жителей Ливонии формально стали лютеранами. В 1554 г. на ландтаге в Вольмаре (Валмиера) была провозглашена свобода вероисповедания во всей Ливонии. Но епископы и высшие чины ордена вплоть до Ливонской войны оставались католиками и выступали против секуляризации церковных земель. Этот консерватизм позволил на какое-то время сохранить орден, его устои и традиции, но, конечно, отнюдь не мог разрешить социальные, политические и религиозные противоречия. Реформация (наряду с военной угрозой, политическими конфликтами, интригами и другими проблемами) способствовала падению ордена.
Ослабление Тевтонского ордена по Торуньскому миру 1466 г. означало для Ливонского ордена потерю союзника и усиление опасного соседа — Польши, стремившейся завладеть и ливонскими землями. Другая угроза исходила от датских королей: в XV в. они возобновили притязания на Северную Эстонию, пытались получить под свой протекторат Эзель-Викское епископство. На северные эстонские территории претендовали и шведы: архиепископ рижский предлагал Швеции эти земли в обмен на военную помощь в борьбе против Ордена. С конца 60-х годов XV в. во владения Ордена стали вторгаться войска московских князей. В 1481 г. русские войска заняли несколько ливонских городов, разрушили Феллин (Вильянди). В 1492 г. Иван III построил крепость Ивангород у границы Ливонии, напротив Нарвы. Она была мощным оборонительным сооружением и одновременно удобным форпостом для наступательных действий.
В связи с этими событиями перед руководством Ордена встали задачи обрести союзников и усилить армию. Новый магистр Вальтер фон Плеттенберг (1494–1535) стремился улучшить вооружение армии, укрепить замки и крепости, вел активную пропаганду, апеллируя к патриотическим чувствам населения Ливонии. Однако на ландтаге 1498 г. выяснилось, что сословия выше всего ставят собственные интересы. Города, на помощь которых рассчитывал Плеттенберг, заявили, что не желают жертвовать ни землями, ни людьми и сами позаботятся о своей обороне. Магистру удалось добиться лишь весьма скромных пожертвований. Во внешней политике дела поначалу тоже складывались неудачно: попытки Плеттенберга найти поддержку у Священной Римской империи, Тевтонского ордена и Польши успеха не имели. Но магистру удалось заключить союз со шведским регентом Стеном Стуре Старшим. В свою очередь, Иван III заключил в 1493 г. союз с Данией — старинным противником Швеции и Ганзы.