Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов

Я спрашивал всех, кого только можно, о способах секвенирования небольших количеств ДНК. В числе прочих я подверг “допросу” шведского биохимика Матиаса Улена, неутомимого изобретателя и предпринимателя от биотехнологий. Матиас обладал безграничной энергией и с детским восторгом относился к новым идеям, заражая своим энтузиазмом творческих людей, неизменно собиравшихся вокруг него. После встреч с ним я всегда возвращался в приподнятом настроении. Одной из творческих личностей в его окружении был Поль Нюрен. Десять лет назад он, несмотря на всеобщий скептицизм, изобрел и разработал новый метод секвенирования ДНК. Матиас тотчас же разглядел научный потенциал изобретения Поля. Еще он осознавал, что технологии секвенирования ДНК пора уже обновлять: мы до сих пор использовали методики, разработанные Фредом Сэнгером в Англии, за что он и получил в 1980 году свою вторую Нобелевскую премию по химии.

Метод секвенирования Сэнгера основан на прикреплении нуклеотидов поочередно друг за другом ДНК-полимеразой, ферментом, который выстраивает новую цепочку ДНК на матрице имеющейся цепочки. В реакции секвенирования ДНК-полимераза берет старт от праймера в назначенном месте ДНК. Далее небольшие порции каждого из четырех нуклеотидов метят разными флуоресцентными красителями и, кроме того, немного изменяют их химически. В результате после встраивания такого измененного нуклеотида реакция секвенирования останавливается именно в месте его прикрепления. Получаются цепочки ДНК разной длины, и концы таких фрагментов раскрашены разными цветами. По этим цветам можно понять, что за нуклеотид сидит на конце. Эти фрагменты — а они разной длины — подвергают процедуре электрофореза. При электрофорезе кусочки ДНК распределяются в геле соответственно своим размерам (длинам, молекулярным весам). И тогда можно посмотреть, как цветные метки и, следовательно, нуклеотиды в этом геле расположены: например, метка и нуклеотид в 10-й позиции от места старта, в 11-й позиции, в 12-й и т. д. На самом лучшем оборудовании для считывания, какое использовалось, к примеру, в проекте “Геном человека”, можно анализировать сразу сотни фрагментов ДНК длиной до 800 нуклеотидов. И что же проделал Поль Нюрен в лаборатории Матиаса? А вот что: он изобрел новый метод секвенирования, так называемый метод пиросеквенирования. И хотя пиросеквенированию предстояло еще хорошенько повзрослеть, но в перспективе оно обещало стать и быстрее, и проще метода Сэнгера.

При пиросеквенировании тоже используется ДНК-полимераза; она так же выстраивает комплементарные цепочки ДНК на матрице, но определение череды новоприкрепленных нуклеотидов устроено по-другому, в обход трудоемкого процесса разделения фрагментов по размеру. В этом случае нуклеотиды определяются по световым вспышкам, которые испускаются в момент присоединения нуклеотида к цепочке ДНК. Поль придумал, что можно добавлять в реакционную камеру по одному из четырех типов нуклеотидов по очереди. И тогда при добавлении, например, А (аденина) к исходной цепочке с концевым Т (тимином) ДНК-полимераза пристроит аденин к тимину, и в этот момент в результате химических реакций произойдет световая вспышка. Эту вспышку можно зафиксировать мощной камерой и передать на компьютер. А если в концевой позиции стоит не тимин, а любой другой нуклеотид — что же, тогда реакции не произойдет и светового импульса не будет. Поль добавлял в реакционную камеру по очереди нуклеотид за нуклеотидом, повторяя цикл за циклом. По вспышкам света он мог прочитать всю нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. Прекрасный метод: требуется только своевременно добавлять нуклеотиды и другие компоненты в реакционную камеру и следить за отснятыми картинками. Но что еще лучше — этот процесс можно легко автоматизировать. И когда Матиас обо всем этом рассказывал, я воодушевился не меньше, чем он.