Скоро однако за этим славным временем мира, процветания и благополучия ее он посылает ей и тяжкие испытания и, в годину междуцарствия и литовского разорения, ввергает ее в пучину самых ужасных бедствий. Страдания, которым тогда враги подвергли обитель, так трогательны, что мы не можем не описать их словами самой летописи. В 7117 (1609) году, когда вражеские польские и литовские полки короля Жигмонта пошли на город Углич, обитель была разграблена и разорена.
Немного оправившийся и восстановленный через семь лет после этого разорения в царствование Михаила Феодоровича Николо-Улейминский монастырь скоро затем в 7127 (1619) году вторично был вместе с городом Угличем опустошен, а братия его с игуменом Ионой перебита литовскими и польскими людьми разбойничьей шайки пана Микулинского.
Только после заключения с Польшей окончательного мира в 1620 году мог начать снова беспрепятственно обновляться и населяться монастырь, и тогда – «о, чудесе твоего, угодниче Христов, Святителю Николае! – твой образ (среди смут) невидимою рукою восхищен быв лете по воздуху дало полупоприща; и по времени паки на том же месте падшей соборной церкви явися, верными обретен бысть и в чудесном видении стоящ». Бедствия обители послужили поводом к новой славе ее и чудотворного образа, и с окончанием их опять наступили для нее дни благоденствия и процветания под явным покровом Святителя. В 1624 году первый государь нового царского дома Романовых, Михаил Феодорович, своей грамотой снова закрепил за обителью ее прежние вотчины. В то же время Ростовский митрополит Варлаам II, бывший прежде ее игуменом, всячески заботился о восстановлении ее прежнего благолепия. Старанием его каменный соборный храм Угодника, разрушенный так варварски врагами, снова был восстановлен из развалин; приведены были в благолепный вид также другие церкви; снова обитель наполнилась иноческим чином, «и тако, благодатию Христовою и молитвами Николы Чудотворца, сия святая обитель паки обновися».
К числу достопримечательнейших событий в последующей жизни обители нужно отнести прежде всего принесение в обитель в 1708 году части мощей Святителя Николая. Монастырю эта святыня досталась в наследие такими путями. В 1699 году в октябре месяце благочестивейший государь Петр Алексеевич, когда путешествовал в Амстердам и отсюда в Бар-град и другие немецкие земли, принес из-за моря в Русскую землю и часть священных мощей Святителя Николая и пожаловал ею московскую боярыню Прасковью Алексеевну Нарышкину, мамку царевича Алексея Петровича. Этой же мамкой, боярыней, часть мощей в особом ковчежце была принесена 5 февраля 1708 года сначала в Угличский уезд, а потом вкладом – в обитель, по обещанию ее, в благодарность за исцеление в обители Чудотворцем прежде бывшей у нее падучей болезни. «И по том же тогда принесение в обитель священные части чудотворных мощей Святителя Христова Николы, – повествует сказание, – паки быша велия чудотворения благодатная, целебная подаваема болящим действа, всем с верою приходящим и молящимся сущим людем пред чудотворным образом Святителя Христова Николы и целующим часть святых мощей его».
В 1710 году кроме того были принесены в обитель части ризы Господней, пояса и гроба Пресвятой Богородицы, части мощей св. Иоанна Предтечи и иных преславных угодников Божиих, и ковчег с этими святынями положен в соборной церкви Святителя.
Но особенно наглядно проявилось неусыпное попечение Святителя об этой своей обители в следующем случае чудесного исцеления болящего перед его образом.