Нидхем заявил в ответ, что чрезмерное нагревание разрушило внутри закрытого сосуда содержащийся в воздухе жизненно важный элемент, без которого самозарождение невозможно. Методы газового анализа в то время были еще недостаточно развиты, чтобы разрешить этот спор. В действительности оказалось, что результат, полученный Нидхемом, был следствием скрытой ошибки, обнаружить которую не удалось в течение целого столетия. Известнейшие ученые XIX в., включая Жозефа Луи Гей-Люссака, Теодора Шванна, Германа фон Гельмгольца, Луи Пастера и Джона Тиндаля, были вовлечены в этот спор. Великий французский химик Гей-Люссак поддержал точку зрения Нидхема, обнаружив, что из нагретого в присутствии органического вещества воздуха кислород исчезает, а его отсутствие, как показали дальнейшие опыты, — необходимое условие консервирования продуктов. Однако решающий эксперимент, т. е. эксперимент Реди, но проделанный с микроорганизмами, остался невыполненным.
Вопрос, казалось бы, прост: будут ли расти в стерилизованном органическом настое микроорганизмы в присутствии воздуха, из которого удалены все микробы? Несмотря на кажущуюся простоту вопроса, существовавшая в то время экспериментальная техника не позволяла дать на него убедительный ответ. Было поставлено множество хитроумных экспериментов, но каждый раз исследователи давали неточные или лишь отчасти правильные и противоречивые объяснения наблюдаемого. Поскольку проблема самозарождения имела большое общемировоззренческое и практическое значение, разгорелись бурные дискуссии.
Страсти достигли кульминации в 1859 г., когда Феликс Пуше (1800–1872), директор Музея естественной истории в Руане, опубликовал книгу, где вновь сообщалось об экспериментальном подтверждении самозарождения. Свое предисловие Пуше начал так: "Когда в результате размышлений мне стало ясно, что самозарождение представляет собой еще один способ, который природа использует для воспроизведения живых существ, я сосредоточил все внимание на том, чтобы экспериментально продемонстрировать соответствующее явление. Английский физик Джон Тиндаль (1820–1893), принимавший активное участие в дискуссии, так прокомментировал появление на арене Пуше:
Никогда еще ни один предмет спора не требовал столь холодного и критического ума, как этот, спокойствия в познании столь сложного явления, тщательности в постановке и исполнении опытов, умелого подбора условий и постоянного сомнения в результатах, пока строгая повторяемость не убедит вас в их безупречности. Для человека с темпераментом Пуше подобный предмет таил в себе опасность, которую еще более усиливало его предвзятое отношение к проблеме.
В это время в исследования включился Луи Пастер (1822–1895). Изучая с точки зрения химии процесс спиртового брожения, он вопреки многочисленным возражениям пришел к выводу, что этот процесс вызывается живыми организмами. Проведенные эксперименты послужили хорошей подготовкой для решения последующей задачи. Исследования Пастера — это в методическом отношении безупречно поставленная серия опытов, ознаменовавших собой одно из величайших достижений экспериментальной биологии. В сущности они привели к закрытию долгого спора о самозарождении. Пастер разрешил все трудности, пугавшие его предшественников. Он недвусмысленно показал, что загадочной "первопричиной", витавшей в воздухе и вызывающей в стерильном бульоне рост микроорганизмов, являются те же самые микроорганизмы, которые переносятся частицами пыли.
Рассмотрим вкратце один из самых простых и изящных экспериментов Пастера, убедительность которого поразила даже самого ученого. Нужную питательную среду, например дрожжевой экстракт с сахаром, Пастер помещал в колбы: затем, нагревая их горло в пламени, оттягивал его так, что получились узкие, но тем не менее открытые трубки, изогнутые различным образом (рис. 5). Далее он доводил питательную среду в колбе до кипения и поддерживал ее в таком состоянии в течение нескольких минут, после чего давал ей остыть. Обработанная таким образом среда оставалась в колбах стерильной неограниченно долго даже при контакте с воздухом. К удивлению Пастера, колбы можно было даже перемещать с места на место, не опасаясь заражения среды. Пытаясь объяснить этот эффект, ученый предположил, что воздушный столб в длинном горле действует как своего рода подушка, препятствуя быстрому движению воздуха; в результате проникающая в горло колбы пыль оседает на его стенках раньше, чем достигает питательной среды. Чтобы доказать, что заключенная в колбе питательная среда, будучи инфицированной, способна поддерживать рост микроорганизмов, Пастер обрезал у некоторых колб горло — и вскоре процесс размножения действительно начинался.