Научная работа на тему физиологии нервов поджелудочной железы, которой также руководил Цион, была удостоена золотой медали университета. В 1875 году 26-летний студент закончил учебу, получил ученую степень кандидата естественных наук и приглашение Циона занять должность ассистента кафедры в Медико-хирургической академии. Не оставляя работы, Павлов поступил на третий курс академии «не с целью сделаться врачом, а с тем, чтобы впоследствии, имея степень доктора медицины, иметь право возглавить кафедру физиологии».
После ухода учителя Павлов тоже покинул кафедру, лишив себя места научной работы и хорошего жалованья. Однако уже через несколько месяцев он работал ассистентом профессора К. Устимовича на кафедре физиологии ветеринарного отделения Медико-хирургической академии. Новый руководитель некогда учился у К. Людвига, получив солидное физиологическое образование. В академии имелась отличная лаборатория, сотрудники которой занимались изучением физиологии кровообращения и выделительной функции почек. В период с 1876 по 1878 год Павлов самостоятельно проводил исследования, впервые применив свой метод изучения функций организма. Молодой ученый измерял давление крови у собак, не усыпляя их наркозом и даже не привязывая к столу. Именно здесь разработана и реализована методика вживления конца хронической фистулы мочеточников в покров живота. Поездка в Бреславль летом 1877 года положила начало многолетней дружбе с известным физиологом Р. Гейденгайном. Научная работа отнимала у Павлова много сил и времени, потому выпускные экзамены в академии он сдал с опозданием, но все же в декабре 1879 года получил долгожданное звание лекаря.
«Первое дело — полная самостоятельность и затем возможность вполне отдаться лабораторному делу», — писал Павлов в 1886 году, заняв должность руководителя физиологической лаборатории. Новое место научных исследований находилось в ветхом деревянном доме, ранее служившем дворницкой или баней. Вначале не доставало оборудования, не хватало денег на покупку животных, на выплату жалованья сотрудникам. Несмотря на материальные трудности, ученый считал тот период весьма плодотворным, с особенной благодарностью вспоминая поддержку С. П. Боткина, предоставившего лабораторию и ненавязчиво выступавшего его руководителем. «Идея и осуществление принадлежат только мне, — записано в начале 1883 года, — но я был окружен клиническими идеями профессора Боткина и признаю плодотворное влияние его глубокого и широкого, часто опережающего экспериментальные данные нервизма». Здесь совершились многие значительные открытия Павлова, в частности выявления центробежных нервов сердца.
Летом 1884 года Павлов отправился в Германию для работы в лабораториях Р. Гейденгайна (в Бреславле) и К. Людвига (в Лейпциге). В течение двух лет Павлов совершенствовал свои познания в физиологии кровообращения и пищеварения. Зарубежная поездка вселила в ученого новые идеи и доказала его мастерство экспериментатора. По возвращении в отечество он приступил к работе в Военно-медицинской академии. К тому же времени относится создание новых способов изготовления сердечно-легочного препарата, иначе — изоляции сердца и легких от общего круга кровообращения. В апреле 1889 года Павлов принял участие в конкурсе на должность руководителя кафедры физиологии Петербургского университета. Однако комиссия отвела его кандидатуру, посчитав более достойным Н. Е. Введенского. Профессор тяжело переживал, но этот неуспех был непоследним. Тотчас после избрания его на должность профессора физиологии Томского университета вновь последовал отвод: министр просвещения не утвердил его кандидатуру.
В апреле 1890 года ученого все же назначили профессором кафедры фармакологии в Томском университете, а вскоре пришло уведомление из Варшавы, где также было дано профессорское звание. Однако Павлов никуда не поехал, удовлетворенный местом профессора кафедры фармакологии в Военно-медицинской академии, которого ожидал в течение 5 лет. Важным событием в творческой жизни доктора явилось начало работы в Институте экспериментальной медицины, где знаменитому физиологу пришлось провести все оставшиеся годы. Здесь были созданы все фундаментальные труды по физиологии главных пищеварительных желез, в 1904 году отмеченные Нобелевской премией. В собственном институте сделано открытие в области условных рефлексов, прославившее автора и всю отечественную науку.