Просто геном

Усилия учёных по реорганизации I-Scel не увенчались успехом (что неудивительно, учитывая огромную молекулярную сложность белковых ферментов), и быстро стало очевидно, что поиск других нуклеазных ферментов будет гораздо более перспективным подходом. Фактически, после эксперимента Марии Ясин с I-Scel, учёные уже выделили десятки нуклеаз из широкого спектра организмов и определили точные последовательности ДНК, на которые они нацелены. Но была фундаментальная проблема: подавляющее большинство этих ферментов распознавало последовательности длиной всего шесть или восемь букв – слишком короткие для того, чтобы быть полезными. Эти последовательности встречались в человеческом мире десятки тысяч или даже сотни тысяч раз в человеческом геноме, что означает, что даже если бы нуклеаза могла стимулировать гомологичную рекомбинацию в одном гене, она уничтожила бы почти весь геном в процессе. Клетка будет уничтожена, прежде чем она сможет начать восстановление ДНК.

Исследователи не могли полагаться ни на одну из уже известных ранее нуклеаз, и было нецелесообразно искать новые ферменты для расщепления ДНК, такие, как I-Scel, всякий раз, когда возникала необходимость редактирования нового гена. Если редактирование генов в лечебных целях должно было стать действительным методом исправления мутаций, вызывающих заболевания, врачи не могли просто ждать, пока учёные придут к открытию той нуклеазы, которая будет целенаправленно рассекать конкретную область гена, в котором у пациента обнаруживалась вредоносная мутация.

В 1996 году было проведено исследование, меняющее парадигму, которое представило решение этой проблемы. В исследовательском университете Балтимора профессор Сринивасан Чандрасегаран понял, что вместо создания нуклеаз с нуля, поиска новых в природе или переделывания I-Scel он может использовать гибридный подход, выбирая части белков, которые существовали в природе, и комбинировать их. Он считал, что такие химерные нуклеазы будут отвечать первым двум требованиям нуклеазы, необходимой для редактирования генов: они смогут распознавать и вырезать определенную последовательность ДНК.

Чандрасегаран приступил к экспериментам с химерной нуклеазой, пытаясь адаптировать её для расщепления последовательности ДНК на определённых отрезках. Но как же внести двухцепочечный разрыв именно туда, куда нужно? Собственно задачу разрезания ДНК отлично выполняет нуклеаза Fold – белок, способный разрезать любую последовательность ДНК на некотором расстоянии от места распознавания. Именно его и применил профессор для своих экспериментов. Он использовал семейство встречающихся в природе белков, называемых белками цинковых пальцев, которые названы так, потому что они распознавали ДНК, используя удлинения, похожие на пальцы, удерживаемые вместе ионами цинка и расположенные рядом, как пальцы руки. Каждый цинковый палец, или ZFN (англ. – zinc-finger nucleases, ZFN), как правило, узнает три определенных нуклеотида.

Невероятно, но способ, открытый Чандрасегараном, работал. Его команда наглядно продемонстрировала, что, комбинируя разные цинковые пальцы, можно создать белок, который в клетке будет направленно привлекаться к определенной последовательности ДНК. Если прикрепить такой домен к нуклеазе, то полученный белок будет разрезать ДНК только в нужном месте! Вскоре Чандрасегаран стал сотрудничать с профессором Университета Юты Даной Кэрролл с целью научиться использовать эти цинксодержащие белки-нуклеазы. Вместе учёные продемонстрировали, что ZFN так же эффективны, если применить их к клеткам лягушек (популярная модельная система для биологов), и что ZFN-индуцированное разрезание ДНК стимулирует гомологичную рекомбинацию. Затем, проводя эксперименты на плодовых мушках, учёные из лаборатории Кэрролла запрограммировали новые ZFN для нацеливания на ген, участвующий в пигментации желтого тела, и показали, что эта стратегия может привести к точным генетическим изменениям в целом организме. Это стало очень важным событием для генного редактирования. Мало того, что ZFN были достаточно практичны для использования на животных, но, что было ещё более важным, они могли быть адаптированы для таргетинга на новые гены.

Более широкому научному сообществу, наблюдавшему за исследованиями учёных в области редактирования генов, достижение пришлось по нраву и возымело такой успех, что они тут же принялись разрабатывать ZFN для своих целей, пытаясь нацелить и на новые гены и работая над новыми моделями живых организмов. В 2003 году Мэтью Портеус и Дэвид Балтимор стали первыми, кто показал, что ген в клетках человека может быть точно отредактирован с помощью специально созданного ZFN. Вскоре после этого профессор генетики, геномики и эмбриологии Федор Урнов и его коллеги исправили мутацию, вызывающую Х-связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит. Федор Урнов и его коллеги работали над человеческими Т-клетками с мутацией в гене, ответственном за Х-связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID-X).