Просто геном

Они сконструировали ДНК-нуклеотиды с сильным сродством к мутации гена DICS-X. В присутствии двухцепочечной ДНК, называемой донором, введенной с плазмидой и несущей здоровую версию гена, эти нуклеазы вызывают расщепление ДНК, создавая благоприятные условия для гомологичных рекомбинаций между ДНК донора и ДНК клетки. Казалось, возможность использования стратегии редактирования генов для выявления генетических заболеваний никогда не была более реальной прежде!

Между тем ZFN были также приняты к использованию лабораториями, заинтересованными в редактировании генов для совершенно разных целей, таких как производство точно спроектированных сельскохозяйственных культур или моделей животных. В конце 2000-х годов эта технология была успешно применена к растениям табака и кукурузе, демонстрируя, что двухцепочечные разрывы ДНК способствовали высокоэффективной гомологичной рекомбинации во многих типах клеток, а не только в клетках млекопитающих. Одновременно стали появляться сообщения о том, что ZFN использовались для модификации генов у рыб, червей, крыс и мышей. Эта интригующая работа привлекала внимание всё большего числа различных специалистов благодаря захватывающему потенциалу.

Но несмотря на многообещающие эксперименты, ZFN никогда не были широко приняты вне кулуаров. Исследователи, которые использовали их, имели большой опыт в области белковой инженерии, сотрудничали с несколькими лабораториями, которые уже имели подобный опыт применения ZFN, либо же большие кошельки, чтобы платить за конструирование необходимой именно им нуклеазы. Проектирование ZFN оказалось простым – всё, что было нужно сделать учёным, – это просто объединить различные сегменты цинкового пальца таким образом, чтобы они распознавали последовательность ДНК, которую требовалось редактировать. Но применить данный маневр на практике было очень сложно. Большая часть недавно разработанных ZFN просто не распознавала последовательности ДНК, как ожидалось; другие же могли точно распознать участок ДНК для расщепления, но проблемы возникали в ходе последнего.

По тем же причинам, по которым переоборудование I-Scel оказалось непростым, учёным не удалось сделать и ZFN достаточно удобным и полезным инструментом для редактирования генома. Безусловно, результаты экспериментов с ZFN убедительно доказали, что спроектированные нуклеазы – подспорье на пути к цели редактирования генов, но данная область всё ещё ждёт появления качественного нового вида технологии, которая будет более надежной и простой в использовании.

Эта технология – по крайней мере, первая её версия, – была открыта в 2009 году, она основана на исследованиях новых типов белков, обнаруженных в бактериях рода Ксантамона, патогенных бактериях, заражающих растения. Из них были выделены эффекторы, подобные активаторам транскрипции, белки под названием TALE (transcription activator-like effector). Белки растительного патогена Ксантамона обладают свойствами активаторов транскрипции в растительных и животных клетках и связываются со специфическими нуклеотидными последовательностями ДНК, которые соединены с доменом неспецической бактериальной эндоеуклеазы Fold. Эти белки по своей структуре очень похожи на белки цинкового пальца: они построены из множества повторяющихся сегментов, каждый из которых распознает определённую область ДНК. Но есть различие: когда каждый цинковый палец распознает трехбуквенную последовательность ДНК, каждый сегмент в TALE распознает одну букву ДНК. Это различие позволило вывести код для сегмента, который будет распознавать данную букву ДНК, затем учёные расположили сегменты один за другим, чтобы распознать более длинную последовательность ДНК в гене.

Началась активная работа для исследования этой находки. Вскоре после того как код был обнаружен, три лаборатории объединили белки TALE с тем же модулем расщепления ДНК, который использовался в случае с ZFN, и создали нуклеазы, подобные транскрипционному активатору назвав их TALENs. TALENs были чрезвычайно эффективны для инициации редактирования генов внутри клеток, и после того как исследователи внесли некоторые улучшения в их дизайн и конструкцию, TALENs, казалось, было бы гораздо проще создавать и внедрять в клетки, чем ZFN.

Как только TALENs были обнаружены и адаптированы для редактирования генов, их вытеснило следующее открытие в области редактирования генов. Технология носила название CRISPR, и именно она ознаменовала вступление редактирования генов в новую эпоху научной истории.

Crispr-зоопарк