Простое начало. Как четыре закона физики формируют живой мир

Так, в рамках одномолекулярного секвенирования в реальном времени (SMRT), выведенного на рынок компанией Pacific Biosciences, отдельные молекулы нетипичной ДНК-полимеразы фиксируют в наноячейках на кремниевой подложке с алюминиевым напылением и, прицельно освещая через дно, наблюдают за их работой¹⁰. Подложка обладает такими оптическими характеристиками, что флуоресцирующие разными цветами нуклеотиды видны только в момент их встраивания в растущую молекулу ДНК[55].

В самой интересной из новых технологий секвенирования ДНК, нанопоровой, не используют ни растущую ДНК, ни цветные нуклеотиды, ни даже ДНК-полимеразу¹¹. Здесь можно пренебречь всем, что на последних страницах было написано о методах, в которых секвенирование привязано к синтезу, и вернуться к тому, с чего мы начинали: поочередно определять нуклеотиды на уже сформированной нити ДНК. Как мы помним, различать основания с помощью света невозможно, зато можно рассчитывать на электричество.

Представьте единственную пору нанометрового масштаба в мембране, разделяющей резервуар с жидкостью на два отсека. В водном растворе по обе стороны от нее содержатся ионы – электрически заряженные атомы или молекулы. При приложении к резервуару напряжения ионы начинают проходить сквозь пору, и силу этого электрического тока можно измерить. Если пора частично перекрыта, ток будет слабее – иными словами, сила тока показывает, насколько пора доступна ионам. Теперь представьте, что через пору протискивается нить ДНК. Ее основания – A, Ц, Г и T – различаются числом атомов и размерами, а следовательно, попадая в пору, по-разному снижают силу тока. Чтобы превратить этот принцип в метод секвенирования, нужно уметь оптимально протаскивать ДНК сквозь пору. В первых устройствах отрицательно заряженная по своей природе ДНК перемещалась, как и прочие ионы, под действием разности потенциалов на сторонах мембраны. Но работало это плохо – в основном потому, что молекула проскальзывала через пору слишком быстро и точно измерить силу тока при прохождении каждого нуклеотида не получалось. Как же решили эту проблему? Один из подходов задействовал белки. Существует немало белков, которые в норме передвигаются вдоль ДНК и совершают с ней какие-то действия, – например, ДНК-полимеразы или хеликазы. Если зафиксировать один из таких белков у входа в нанопору (на следующем рисунке изображен как светло-серые спирали¹²), он будет своим обычным рабочим инструментарием размеренно направлять ДНК в пору. Из главы 2 мы узнали, что многие белки можно считать природными машинами нанометровых масштабов. Здесь одну из них нагрузили работой в месте, недоступном для других исполнителей. Кроме того, белки способны формировать и сами поры: как мы выяснили в главе 2, многие пронизывающие мембрану белки могут укладываться так, что внутри них образуется сквозной канал. И вот мы снова наблюдаем самосборку.

Концепция нанопорового секвенирования проста, и еще в 1980-х в ней читались задатки перспективной технологии. Ее реализация, однако, потребовала немалых усилий. Сначала ученые показали надежность внедрения нанопор в искусственные барьеры – тогда еще не с целью секвенирования, а просто для понимания структуры пор и разработки платформ, позволяющих работать с мембранно-белковыми комплексами. Первые опыты по переносу ДНК через поры с помощью электрического поля помогли разобраться в физике движения в ограниченных пространствах. Хотя к началу 2000-х специалисты уже располагали основными принципами, многим сторонним наблюдателям, включая меня, было сложно разглядеть в нанопоровом секвенировании мощную и надежную технологию будущего. Необходимо было искусно скомпоновать поры, ДНК-связывающие белки, мембраны в несколько нанометров толщиной и электроды. Затем нужно было отработать высокочувствительные измерения силы тока и исключить при этом закупорку пор примесями или поврежденными белками. Эту пугающую инженерную задачу взвалила на себя компания Oxford Nanopore, которая занимается, как можно догадаться, в основном нанопоровой детекцией молекул. Первый прибор ученым представили в 2014 году – это была пилотная версия для оценки эффективности метода, – а теперь на рынке мы можем выбирать уже из нескольких разных аппаратов. Самый маленький сравним по размеру с большим пальцем или флешкой и, прямо как она, подключается к компьютеру через USB-порт. Привлекательность прибора во многом объясняется портативностью и низкой стоимостью. Например, в 2014-м с его помощью секвенировали геном эболавирусов, выделенных из 14 гвинейских пациентов. Его картировали уже через два дня после взятия проб, блестяще продемонстрировав потенциал скоростного секвенирования в полевых условиях. Эта технология позволяет оперативно выявлять источник распространения болезни и потенциально опасные варианты патогенов.