Расшифрованная жизнь

Но, как обычно, возникли проблемы. Нужно было получить геном человека в форме, пригодной для этих экспериментов. Даже в виде хромосом, то есть в том виде, в котором он находится в клетках, размер этого кода слишком велик для исследований. Для успешной «охоты на гены» необходимо разделить генетический код человека на пригодные для работы участки. Если взять полный набор ДНК в клетке человека и разделить его на части, то в итоге получится то, что ученые называют «библиотекой». Существуют два основных типа библиотек ДНК – геномные и клоновые.

Геномная библиотека ДНК создается с помощью специальных ферментов, называемых рестриктазами, которые разрезают хромосомы человека на мелкие кусочки, каждый из них состоит примерно из 15–20 тысяч пар оснований ДНК. Чтобы изучать эти части ДНК человека, нужно уметь их копировать и хранить, точно так же, как книги – печатать и переплетать. В процессе копирования каждый фрагмент ДНК человека прикрепляется к ДНК бактериофага – вирусу, который инфицирует бактерии и размножается внутри них. Такой обработанный бактериофаг, несущий в себе ДНК человека, используют для инфицирования бактерии кишечной палочки E. coli. Если налить в чашку Петри бульон с инфицированной кишечной палочкой E. coli, то на бактериальном газоне появятся стерильные пятна – там, где вирусы убили E. coli. Эти пятна, бляшки, содержат миллионы вирусных частиц – и следовательно, миллионы копий фрагментов ДНК человека.

Клоновые библиотеки ДНК составляют на основе другого генетического материала в клетках – матричной (информационной) РНК, переносящей геномную информацию для сборки белка. Только 3 % нашего генетического кода отвечает за кодирование белков, поэтому мы получаем гораздо более компактный «рабочий чертеж» ДНК человека, если сосредоточим внимание на РНК, кодирующую эти белки. (Типичный ген может содержать миллион пар оснований, а длина «отредактированной» РНК может доходить всего лишь до тысячи пар оснований.) Другими словами, такая библиотека ДНК использует тот же способ, с помощью которого природный «издатель» превращает весь генетический код в гораздо меньшие матричные РНК – лишь субпопуляции генов, необходимых для создания специфичных клеток или тканей.

По своей природе матричная РНК недолговечная и нестабильная молекула, в противном случае мы бы просто выделили ее из клетки и прочитали. Однако с помощью фермента «обратная транскриптаза» РНК нетрудно скопировать в стабильную молекулу ДНК. Это называется комплементарной ДНК или кДНК. Выделяя РНК человека для изготовления кДНК, мы получаем сжатый, легко читаемый вариант генома с кодирующими белок генами.

Как и в геномной библиотеке, каждый том комплементарной библиотеки должен быть представлен в удобном для обработки и копирования виде. Природа решила и эту проблему. Комплементарные библиотеки ДНК получают путем выделения матричных РНК в тканях, преобразуют эти РНК в комплементарные фрагменты ДНК и встраивают их в плазмиды, небольшие кольцевые молекулы ДНК с инструкциями для бактерии. Бактерии кишечной палочки E. coli, инфицированные этой кДНК, играют роль «печатного станка» книг для этой библиотеки. Каждая бактерия содержит соответствующий сегмент кДНК человека, и когда бактерия реплицируется (делится на дочерние клетки), то и материнские, и дочерние клетки получают одинаковые фрагменты гена человека.

Эти фрагменты ДНК невидимы для невооруженного глаза, но их легко разглядеть с помощью специальных приборов. На дно чашки Петри наносят очень тонким слоем, чтобы по возможности избежать соприкосновения колоний бактерий, бульон с E. coli, содержащими кДНК человека. Отдельные колонии бактерий начинают расти, и когда они в итоге становятся различимы глазом в виде пятен, в каждой из них оказываются миллионы идентичных бактериальных клеток (клонов), и в каждой из этих клеток находится одинаковая часть кДНК человека. В небольшой чашке Петри можно получить десятки и сотни тысяч таких изолированных колоний и создать обширную библиотеку ДНК человека.

С помощью любой из таких библиотек мы начинаем охоту на рецептор, используя способ крепления комплементарных ДНК. Фильтровальной бумагой удаляем ДНК из чашек Петри с E. coli, вырастившей геномную или комплементарную библиотеку ДНК. Фильтровальную бумагу затем замачиваем на ночь в растворе рецепторного ДНК-зонда. Чтобы определить, связан ли он с комплементарной ДНК в библиотеке, зонд метят радиоактивным изотопом фосфора Р-32, заменяя им некоторые атомы фосфора в молекуле ДНК. Затем фильтры промывают, чтобы удалить все следы радиоактивного зонда, которые не присоединились ни к одному из фрагментов ДНК, сушат и помещают на несколько дней в кассету с рентгеновскими пленками. Положительные колонии и бляшки – области, где радиоактивный зонд прикрепился к целевой ДНК-мишени, видны на проявленной рентгеновской пленке как черные пятна. Сравнивая пятна на пленке с пятнами в чашке Петри, положительные колонии или бляшки можно идентифицировать, а затем выделить и амплифицировать их ДНК.