Расшифрованная жизнь

Заметим, что найти нестабильную матричную РНК, кодирующую определенные белки, не так-то просто. В каждой клетке есть всего несколько тысяч молекул трудно выделяемых мембранных белков, например адреналиновых рецепторов. Как следствие, невелико также и количество матричной РНК, кодирующей рецепторный белок. Используя генетический материал мозга человека, полученный для медицинских исследований, нам приходилось изучать более миллиона колоний кДНК, чтобы найти именно ту, которая содержала матрицу для создания адреналинового рецептора. Мы вырастили колонию для производства достаточного количества такой ДНК и с ее помощью сумели ее секвенировать – определить порядок расположения четырех нуклеотидов (C, G, A и T), формирующих звенья в молекуле ДНК с внешним остовом из сахара и фосфата. Порядок расположения пар оснований в ДНК определяют с помощью двух основных методов секвенирования. Один из них был разработан в Лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям в Кембридже Фредериком Сенгером, блестящим ученым, (кстати, разделяющим мою любовь к парусному спорту){15}

, который однажды сказал, что «у него все в порядке с головой, но не очень хорошо с болтовней». Второй был описан гарвардским ученым Уолли Гилбертом, известным как «серый кардинал с грандиозными замыслами». В 1980 году Гилберт и Сенгер получили Нобелевскую премию. Большинство экспериментов по секвенированию, проведенных в последние десятилетия, являются прямым продолжением именно метода Сенгера, которому удалось разрешить некоторые сложнейшие проблемы биологии. В мае 1975 года Сенгер потряс научный мир, частично секвенировав ДНК, а затем впервые полностью секвенировав геном вируса: 5375 пар оснований генетического кода бактериофага phi-X174. Позднее Сенгер секвенировал приблизительно 17 тысяч (или около того) пар оснований ДНК митохондрий человека (энергетических фабрик наших клеток), положив начало первому проекту по расшифровке генома человека.

Метод расшифровки ДНК, впервые предложенный в Кембридже Сенгером совместно с Аланом Коулсоном, состоит в создании многочисленных копий молекул ДНК с использованием фермента ДНК-полимеразы. Для репликации ДНК этой полимеразой ее помещают в раствор из нуклеотидов – строительных блоков ДНК. Фермент считывает информацию с каждого конца первичной нити ДНК, используя нуклеотиды для создания новых копий. Вклад Сенгера состоял в добавлении в этот раствор дополнительного ингредиента – «нуклеотидов-терминаторов», помеченных радиоактивным P-32. Эти нуклеотиды присоединяются к растущей копии и случайным образом прекращают действие полимеразы, помечая конец растущей цепи радиоактивной меткой. Поскольку это может происходить на любой стадии образования в пробирке множества копий молекул ДНК, в результате образуется смесь фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых оканчивается радиоактивно помеченными C, G, А или T, – смотря по тому, какое основание помечено P-32.

Затем фрагменты пропускают через слой геля, на котором молекулы ДНК под действием электрического поля разделяются в зависимости от размера. Теперь можно прочитать последовательность, поскольку более крупным фрагментам ДНК требуется больше времени для прохождения через гель. Поскольку метки на всех четырех нуклеотидах – C, G, A, T – одинаковы и оставляют одинаковый след в виде черных полосок на рентгеновской пленке, необходимо проводить четыре отдельных эксперимента, по одному на каждую букву кода. После использования ДНК-полимеразы для каждого из четырех нуклеотидов-терминаторов (в одной серии опытов помечены все C, в другой – все G, и так далее), их помещают на четыре соседние дорожки на том же самом геле. Когда фрагменты разделяются, одна дорожка демонстрирует фрагменты ДНК, оканчивающиеся на С, другая – оканчивающиеся на G, и так далее.

Гель высушивают, выдерживают несколько дней на рентгеновской пленке, оставляя четыре параллельные дорожки с черными полосками, потом внимательно изучают пленку, начиная с первой из четырех дорожек. Так и получают искомую последовательность, записывая по порядку каждую следующую букву сотни раз для каждого образца. Это трудоемкий и длительный процесс, в течение которого могут происходить – и происходят – всяческие сбои. Если одна из четырех реакций на геле не получилась, весь эксперимент идет насмарку; нередко случается, что дорожки располагаются не параллельно друг другу. Это затрудняет сравнивание черных меток и пробелов на каждой из дорожек и считывание всей последовательности. При высыхании гель может растрескаться, и часто именно так и происходит. Реагенты могут разлагаться, и это тоже часто у нас случалось…