С этой минуты посещения Борисом Годуновым монастыря и сестры-инокини становятся все более редкими. Ирина-Александра замыкается в своих монастырских палатах, достаточно скромных по отделке. С северной стороны вдоль всего их фасада шла открытая галерея-гульбище. На галерею вела широкая лестница. Возможно, что венчал здание достаточно затейливый деревянный терем с крутой высокой кровлей. Из палат былой царицы можно было пройти в трапезную, а через нее в церковь, которая сначала была посвящена Иоанну Предтече – святому, соименному Грозному. Отсюда название соседней монастырской башни – Предтеченская.
Можно предположить, что церковь в ее первоначальном виде была построена в 1560-х годах, когда приняла постриг невестка Ивана Грозного, княгиня Ульяна. Храм многократно перестраивался. Изменилось и его посвящение – теперь во имя святого Амвросия Медиоланского. Подобное посвящение достаточно необычно для Московского государства и самой Москвы. Покровитель города Милана, один из видных учителей церкви, сторонник полной ее независимости от государства, Амвросий имеет большие заслуги в отношении церковного пения как составитель многих текстов. Им также введен так называемый амброзианский напев, своеобразная ритмическая мелодия, заключавшая элементы восточного церковного пения и древнегреческой речитативной музыки. Тоны и гласы установлены Амвросием в полном соответствии с напевами православной греческой церкви.
Монастырская жизнь Ирины-Александры продолжалась недолго. Ее не стало в 1603 году.
Между тем монастырь неуклонно продолжал богатеть. С 1524 года до начала XVIII века его земельные владения увеличиваются больше чем в сто раз: с 1600 до 164 215 десятин земли. К концу XVII века ему принадлежало четырнадцать с половиной тысяч крестьян (женщины в расчет не принимались), слобода, располагавшаяся вдоль дороги к Кремлю. В слободе жили обслуживавшие нужды монастыря сапожники, суконщики, портные, огородники, хлебники, пивовары, плотники, горшечники, кузнецы. По сравнению с крестьянами они освобождались от всех налогов и повинностей. Кроме того, в 1638 году в слободе жили 127 ремесленников, которые на случай войны обязаны были браться за оружие – пищали, сабли, рогатины.
В XVI – начале XVII века Новодевичий монастырь представлял мощную крепость, отвечавшую всем требованиям современной фортификационной науки. Его гарнизон насчитывал 300–350 стрельцов. Для многих городов это равнялось численности целого городского гарнизона. Само положение монастыря было определено именно из этих соображений: в излучине Москвы-реки поблизости находились три очень важные водные переправы – у Дорогомилова, Воробьевых гор и Крымского брода. В 1521 году здесь беспрепятственно перешел реку крымский хан Махмет-Гирей, но уже в 1591 году полки крымчаков под предводительством Казы-Гирея вынуждены были отступить из-за сильного артиллерийского огня крепостей южного оборонительного кольца.
В Смутное время монастырь неоднократно переходил из рук в руки. В 1610 году его захватили иностранные полки. В 1611-м в нем стояли две роты польского войска и отряд немецких наемников. 22 мая 1611 года войска первого московского ополчения овладели Белым городом и на следующий же день Новодевичьим монастырем. Но в июле опять появились иностранные части. Особенно бесчинствовали здесь казачьи отряды И. Заруцкого, перешедшего в это время на сторону польского короля Сигизмунда. Монастырские сокровища были разграблены и сожжены, казаки, по словам летописца, «церковь и монастырь выжгли».
22 августа 1612 года второе народное ополчение под руководством Д. Пожарского и К. Минина встретило неподалеку от монастыря польские отряды гетмана Ходкевича. Поляки переправились через Москву-реку именно у Новодевичьего монастыря и напали на отряды Пожарского у Чертольских ворот. Семичасовая кровавая битва закончилась поражением и бегством Ходкевича. Два дня спустя поражение иноземных отрядов оказалось полным. И сразу же после освобождения Москвы от врагов ополченцы освободили и монастырь.
Настоящей строительницей Новодевичьей обители становится царевна Софья. В годы ее правления возобновляются сохранившиеся до наших дней стены и башни, в основных своих частях на древних фундаментах. Общая их протяженность составляет около 950 метров. По свидетельству документов, площадь обители была несколько меньшей: длина ее стен равнялась 638 метрам и вместо двенадцати ныне существующих башен было всего десять. Посередине северной и южной стен находилось по одной проездной – воротной башне, которые имели фресковые росписи. Над южной проездной башней возвышалась надвратная Покровская церковь, к которой примыкают Мариинские палаты – некоторое время в 1690-х годах в них жила старшая сводная сестра Петра Марья Алексеевна. Церковь и палаты имеют единое архитектурное оформление. Храм и третий этаж палат поставлены на общую для них галерею-гульбище. Существует предположение, что здесь же некоторое время находилась и сама правительница, царевна Софья.