По плану отряд кораблей на большой скорости должен был приблизиться на расстояние 500 миль от побережья Японии, выпустить самолеты и тут же покинуть район действия. Дункан предложил действовать с малых высот. Это позволило бы самолетам избежать обнаружения радарами, а также повысило бы точность бомбометания. Самолеты, взлетев с авианосца и сбросив бомбы на цель, должны были приземлиться на не оккупированной территории Китая. Командовать авиаотрядом назначили летчика-испытателя, подполковника Дулиттла, автора многочисленных воздушных рекордов. 31 января бригадный генерал Карл Спаат, офицер службы разведки Арнольда, передал Дулиттлу список из десяти японских городов, в том числе Токио, Кобе, Нагоя и Иокогама, а также указания на цели в каждом из этих городов. В списке целей значились авиационные заводы, морские базы, нефтеперегонные заводы и другие важные оборонные объекты.
2 февраля 1942 года провели пробный старт В-25 с палубы авианосца «Хорнет». Авианосец встал в строй незадолго до начала войны и с января 1942 года находился в составе Тихоокеанского флота США. Рейд на Японию должен был стать его первой боевой операцией.
После успешных предварительных испытаний приступили к подготовке самой операции. Прежде всего из добровольцев начали комплектовать экипажи, готовые рискнуть жизнью. Для операции выделили 24 самолета В-25, включая резервные машины. На самолеты поставили дополнительный бак объемом 852 литров, что увеличило запас топлива с 2445 до 4319 литров. Однако выяснилось, что бак не имеет самогерметизирующихся стенок, поэтому вместо него установили другой. Над бомбоотсеком установили еще один бак объемом, 606 литров. По сути, это был мягкий резиновый мешок. Пустой бак можно было отодвинуть вбок, чтобы открыть сообщение между носовой и хвостовой частями фюзеляжа. На место снятой нижней турели установили вспомогательный бак объемом 227 литров, а рядом с радиостанцией установили десять канистр, объемом 19 литров каждая. Хвостовой стрелок должен был следить за уровнем топлива во вспомогательном баке и подливать туда бензин из канистр по мере расходования. Опустошив канистру, стрелок должен был проделать в ней несколько дыр и выбросить за борт. Дырявая канистра тонула, не оставляя следов на поверхности. Размещение такого количества бензина на борту самолета было очень опасным делом. Авария при взлете, пожар на борту корабля или попадание зажигающей пули могли в один миг превратить самолет в огненный шар. Но другого способа долететь до Японии не было. Бомбонагрузку ограничили двумя 227‑кг фугасными бомбами и двумя 227‑кг кассетными зажигательными бомбами, по 128 штук в каждой. Кроме того, на самолетах установили новые прицелы, позволяющие бомбить с малой высоты, и автопилоты. Следующим вопросом стало усиление оборонительного вооружения. Турель с двумя 12,7‑мм пулеметами часто заклинивало.
Когда огонь велся вдоль фюзеляжа, пороховые газы нередко разрушали обшивку самолета. Поэтому верхнюю часть фюзеляжа за турелью усилили металлическим листом. С самолетов сняли почти весь комплект осветительных ракет, которые могли самопроизвольно сработать и вызвать пожар. Оставили лишь две ракеты для посадки в темноте, разместив их за бронированным изголовьем пилотского кресла, где они находились в относительной безопасности. Подполковник Дулиттл требовал, чтобы во время перелета сохранялось полное радиомолчание. Поэтому с машин сняли передатчики. Это не только облегчило машины, но и исключило возможность какого-либо неумышленного выхода в эфир. На командирской машине и на машинах командиров звеньев установили хвостовые фотокамеры, которые должны были снимать результаты бомбометания. Они включались автоматически после освобождения бомбодержателей. Далее камеры делали 60 снимков с интервалом в полсекунды.
После интенсивной подготовки отобрали 16 экипажей, которые прибыли на борт авианосца «Хорнет». 1 апреля 1942 года на палубу авианосца доставили 16 В-25.
На следующий день авианосец и сопровождающие корабли вышли в море. Старт самолета Дулиттла наметили на полдень 19 апреля с тем, чтобы появиться в районе Токио перед закатом. Остальные машины должны были взлететь спустя три часа и прибыть к цели уже в темноте, ориентируясь по пожарам, вызванным Дулиттлом. Дулиттл надеялся приземлиться на аэродроме в Китае с последними лучами заката, а остальные самолеты должны были приземлиться уже 20 апреля.
Накануне вылета кораблям эскадры следовало пополнить запасы топлива с тем, чтобы в оперативном районе двигаться на полном ходу: сначала выдвинуться к месту старта бомбардировщиков, а затем немедленно покинуть район.