Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

Чалфи тоже не купался в деньгах, но обладал изобретательностью, которая очень помогла ему в исследовательской работе. Например, его лаборатория не могла позволить себе флуоресцентный микроскоп (чтобы наблюдать свечение GFP внутри отдельных клеток), поэтому Чалфи приглашал к себе торговцев лабораторным оборудованием, брал у них микроскопы на “испытательный срок", делал нужные снимки и анализы, а потом возвращал приборы обратно, так ничего и не купив.

В 1994 году Чалфи и его коллеги, включая Прэшера, опубликовали в журнале Science статью о том, что с помощью генной инженерии можно соединять ген GFP с другими генами живых организмов, а по свечению определять локализацию кодируемых ими белков³⁰². Впоследствии благодаря GFP стало возможно увидеть под микроскопом, как развивается нервная система, как клетки поджелудочной железы, производящие гормон инсулин, организуются в ходе эмбрионального развития, как белки транспортируются в клеточное ядро или из ядра и вообще из одной части клетки в другую, как раковые клетки распространяются по телу человека и так далее.

Тем временем сотрудники лаборатории Цяня обнаружили в гене GFP мутации, из-за которых белок становился более ярким³⁰³, а также мутации, меняющие цвет флуоресценции белка. Благодаря его исследованиям арсенал ученых пополнился желтыми, оранжевыми, красными и другими флуоресцентными белками и их генами. Впоследствии решение Прэшера “поделиться” геном GFP с коллегами принесло великую пользу науке, но стоило ученому Нобелевской премии, на вручении которой он присутствовал почетным гостем, а не лауреатом. Премию за GFP разделили Цянь, Чалфи и Симомура, люди, успевшие внести наибольший вклад в его изучение, что не отменяет заслуг первооткрывателя гена. Последовательность исходного гена GFP Прэшера из оригинальной публикации вы можете увидеть ниже.

Кроме мутационного подхода для создания новых форм светящихся белков, который использовали в лаборатории Цяня, есть еще один способ – поиск уже существующих в природе генов флуоресцентных белков (как это делал Доктор М). С этим подходом преуспели в лаборатории академика Сергея Лукьянова из Института биоорганической химии РАН. Ученые открыли ярко-зеленый флуоресцентный белок на щупальцах актинии Anemonia majano, желтозеленый белок на щупальцах мягкого коралла рода Zoanthus, сине-зеленый белок на полосах и красный белок на пятнах дисков “грибного коралла” Discosoma striata и другие белки³⁰⁴. Позже эксперименты с различными флуоресцентными белками и их мутантами позволили создать белок, со временем меняющий цвет флуоресценции от зеленого к красному³⁰⁵. При помощи этого белка можно изучать, как меняется локализация или концентрация в клетке других белков, соединенных с такими светящимися “молекулярными часами”.

Еще одну замечательную идею с использованием флуоресцентных белков придумала группа молекулярных биологов из Гарварда во главе с Джефом Лихтманом и Джошуа Сейнсом. В 2007 году они опубликовали в журнале Nature статью о новом методе исследования связей между нервными клетками мозга – Brambow™ (от слов brain – “мозг” и rainbow – “радуга”, то есть “мозговая радуга”). Метод основан на том, что в результате особой рекомбинации в отдельных нервных клетках генетически модифицированного организма оказывается свой уникальный набор генов флуоресцентных белков. Разные соотношения красных, зеленых и синих белков создают уникальные цвета, поэтому отдельные нейроны и их отростки окрашиваются по-разному. Это позволяет создавать удивительной красоты изображения структур мозга и видеть, какие нервные клетки соединены отростками.

Но вернемся к нашей текущей задаче – создать работающую плазмиду с флуоресцентным геном. Сначала мы спланируем ее на компьютере, а потом рассмотрим, как получить соответствующую последовательность ДНК в пробирке. В конце мы перенесем плазмиду в бактерию. Давайте выберем предложенный ген GFP или его аналог, цвет и яркость которого нам больше подходят, и последуем дальше.

Кроме гена GFP, нам понадобится ген, придающий бактерии устойчивость к какому-нибудь антибиотику. Такие гены могут кодировать белки, разрушающие или инактивирующие антибиотик, не впускающие его в клетку и так далее. Примеров и механизмов устойчивости известно множество, причем от разных антибиотиков защищают разные механизмы. После того как мы генетически модифицируем наши бактерии, мы захотим избавиться от тех, которые модифицировать не удалось, и антибиотик нам в этом поможет.