Сумма биотехнологии. Руководство по борьбе с мифами о генетической модификации растений, животных и людей

Конечно, плазмиду можно собрать и самостоятельно, если она состоит из фрагментов других, уже готовых плазмид, геномов вирусов или бактерий, которые у нас хранятся в запаснике. Так поступали ученые, получившие от Прэшера ген GFP, – совмещали готовый ген с уже имевшимися генетическими конструкциями. Процесс сборки плазмиды можно сравнить с тем, как раньше писали анонимные письма, составляя тексты из слов, вырезанных из газет на свежем листе бумаги. Листом бумаги может выступить какая-нибудь существующая распространенная плазмида.

В арсенале генного инженера есть целый набор белков-ферментов, умеющих разрезать и сшивать молекулы ДНК. Как и GFP, эти ферменты были придуманы не учеными, а различными живыми организмами в процессе эволюции, а мы лишь позаимствовали их, приспособив под собственные нужды. Например, белок EcoR1, выделенный из кишечной палочки, относится к группе ферментов, разрезающих ДНК, которые называются рестриктазами. EcoR1 разрезает участок молекулы ДНК, если он выглядит так:

Причем разрезание происходит после буквы G верхней цепи и перед буквой G нижней цепи, как показано ниже.

Полученные концы молекул называются «липкими», потому что они комплементарны друг другу и охотно готовы слипнуться обратно, но для того, чтобы их снова сшить вместе, нам потребуется еще один фермент – ДНК-лигаза. Ученые нашли уже сотни разных видов рестриктаз, которые могут разрезать совершенно разные фрагменты ДНК. Некоторые рестриктазы узнают короткие (часто встречающиеся) последовательности. С их помощью молекула ДНК будет разрезана сразу во многих местах, и получатся короткие фрагменты. Рестриктазы, узнающие длинные последовательности нуклеотидов, используются, чтобы разрезать ДНК на более крупные куски. Одни рестриктазы разрезают ДНК в том участке, который они непосредственно распознают, другие могут делать разрез на некотором расстоянии от узнаваемого ими места. Бывает, что рестриктазы оставляют не «липкие» концы, а «тупые», как показано ниже.

Вырежем нужный нам фрагмент ДНК с помощью двух рестриктаз. Добавим вырезанный фрагмент к плазмиде, в которой были сделаны разрезы такими же рестриктазами. «Липкие» концы плазмиды и нашего фрагмента сблизятся по принципу комплементарности, а ДНК-лигаза их сошьет. В итоге мы получим плазмиду со вставкой.

Зачем бактериям рестриктазы и не могут ли они порезать свой собственный геном? Оказывается, что эти ферменты – отличное средство от чужеродной ДНК. Допустим, у бактерии есть рестриктаза, которая узнает фрагмент GAATTC и разрезает его. Сама бактерия пришла к такой рестриктазе постепенно, в процессе длительной эволюции, поэтому у нее в геноме крайне мало участков GAATTC. Кроме того, у нее могут быть особые ферменты, которые находят участки GAATTC и прикрепляют к ним метильные группы (из атома углерода и трех атомов водорода). Эта химическая модификация – она называется метилированием – защищает ДНК от действия некоторых рестриктаз.

Если же в бактерию проникнет неприспособленный бактериофаг, то, вероятно, в его геноме найдется незащищенный участок GAATTC и вирус будет беспощадно разрезан.

Для завершения задуманного генно-инженерного проекта понадобятся правильные бактерии. В обычных условиях менее одного процента бактерий готовы захватывать плазмиды. Для того чтобы увеличить эффективность передачи плазмид, бактерии стоит предварительно подвергнуть тепловому шоку. Сначала их держат в прохладных условиях, а потом ненадолго помещают в инкубатор с температурой в районе 42 градусов (разумеется, конкретные значения зависят от вида используемых бактерий). Многие бактерии в результате такого шока переключаются в особый режим, в котором они начинают хватать всякую ДНК из окружающей среды в надежде найти что-нибудь, что поможет им приспособиться и выжить. В природе это способствует повышению генетического разнообразия популяции бактерий, а значит, возрастают шансы, что какие-то особи переживут неблагоприятные условия. Вот таких напуганных бактерий мы и перемешаем с плазмидой, а затем с антибиотиком. Бактерии, захватившие плазмиду с правильной вставкой, обретут устойчивость и выживут, а остальные погибнут.