С началом церковных служб еще больше умножились чудеса от образа святителя. Более всего происходили они во время литургии. Вместе с тем, благословение Божие явно почило и на всем имуществе обители. Нивы ее цвели и давали богатый урожай, скот был здоров и размножался; всеми прочими благами земными она также изобиловала, и число братии ее возрастало. А князь и народ не переставали часто посещать обитель для поклонения и совершения молебствия святителю пред его образом и также делали щедрые приношения ей и ревновали о ее благоустроении.
Такова первоначальная история обители. Основатель ее, старец Варлаам, еще в 1506 году присутствовал в Угличе при погребении преподобного Паисия Угличского. Итак, уже он мог видеть процветание обители и исполнение на ней Угодником своего обещания, данного ему при образе. Еще более, однако, цветущий период в истории обители начинается после его смерти, чрез столетие после основания.
В 1563 году, при князе Угличском Георгии Васильевиче, была выстроена в ней теплая каменная церковь во имя Введения Пресвятой Богородицы, а в 1589 году, при царевиче Дмитрии, такая же и соборная во имя святителя Христова Николая, высокая, каменная со сводами, с погребами, с дверями железными, великолепно украшенная, в которую был перенесен тогда и образ. Кругом вся обитель ограждена была деревянной стеной, а по грамотам государей Василия Иоанновича (1505-1533) и Иоанна Васильевича (1533-1584) она владела несколькими селами и деревнями. К началу XVII века Николо-Улейминский монастырь находился в таком цветущем состоянии, что летописец называет его «дивным и прекрасным». Такова была милость Чудотворца к своей обители.
Скоро, однако, за этим славным временем мира, процветания и благополучия он посылает ей и тяжкие испытания, и в годину междуцарствия и литовского разорения ввергает ее в пучину самых ужасных бедствий. Страдания, которым тогда враги подвергли обитель, так трогательны, что мы не можем не описать их словами самой летописи. В 1609 году, когда польские и литовские полки короля Жигмонта сделали нашествие на город Углич, «тогда презлейшии онии Полякове и литовстии людие и под оный прекрасный и дивный монастырь прибегоша и, обседше оный, яко пчелы сот и яко волцы двор сей словесных овец, ся понуждаху, его хотяще взяти скоро. Игумен же и братия, и елицы граждане и мирстии людие крыющеся в монастыре не даяху им избивати его, крепче сопротивляющеся и входу во врата монастырская не дающе, не ведуще о велицем числе всезлобных врагов. Лива же зельно биющеся и граждан одолеваху. Егда же видяху себе граждане преодолеваемых от множества ратных литовских людей, тогда текоша вси в соборную церковь каменную старую и крепце изнутрь запрошася, совершающе Божественную литургию, исповедающеся и Святых Тайн Тела и Крови Христовы причастишася, вси на смертный час готовящеся и готови быша. По причащении же Святых Таин игумен, именем Варсонофий, сотвори поучение к смерти, еже не боятися ее. Братии и всем бывшим в церкви людем не боятися повелеваше смерти, но паче радоватися, яко мученической кончины сподобляются, и мученики царство небесное наследити глаголаше побиенным. Полякове же утрудившеся бивше во двери церковныя и не возмогше отломити, беша бо зело крепцы, разыдошася; возвратишася от монастыря посрамлении, точию оставиша множество поляков стрещи монастырь. По поучении же игумен облачается во вся священная одеяния и, избрав себе, иже хотяху с ним пити прежде смертную чашу, двадесять седмь братов, прият честный крест в десницу и облобыза его, глаголя: «Радуйся, пречестный кресте Господень! За Распеншагося на тебе нашего ради спасения и мы, грешнии, души своя положим». И дав коемуждо из 27 братий святыи иконы, сотвориша молебная пения и лобызахуся друг со други и изыдоша ко врагом за врата монастырская, хотя врагов укротити. И увещавая их не сотворити зла святей обители. Окаянии же литви, сущие на страже, яко лвы устремишася на преподобных и игумену Варсонофию главу отсекоша. И тогда сущии с ним братия возопиша гласом велиим и сотвориша плач велий. Полякове же, сущии недалече от монастыря, услышавше молву и клич велик, возвратишася паки к монастырю и начата братию мечи рубити и двадесять седмь посекоша и разсекоша на части. Друзии же текоша к соборней церкви и начата жестоко двери церковная бити, но не возмогоша сокрушити, бяху бо зело крепки, зане железнии и тверди бяху, и ту сущии граждане со слезами моляхуся Богу. И бысть, егда видеша окаяннии, яко ничтоже успеша и не возмогут дверей выбита, лютейшую окаяннии казнь умыслиша: рвы глубокия вокруг соборныя церкви окопаша и фундамент подломиша.