Накануне войны с Советским Союзом Вермахт располагал 235 танками Pz.III с 37-мм пушками (еще 81 машина находилась в ремонте). Танков с 50-мм пушками было значительно больше – 1090! Еще 23 машины находились в стадии перевооружения.
В течение июня от промышленности ожидалось поступление еще 133 боевых машин. Из этого количества непосредственно для вторжения в Советский Союз предназначалось 965 танков Pz.III, которые были распределены более или менее равномерно по 16 немецким танковым дивизиям из 19, участвовавших в операции "Барбаросса" (6-я, 7-я и 8-я танковые дивизии имели на вооружении танки чехословацкого производства). Так, например, в 1-й танковой дивизии имелось 73 Pz.III и 5 командирских Pz.Bf.Wg.HI, в 4-й танковой – 105 боевых машин этого типа. Причем, абсолютное большинство танков было вооружено 50мм пушками L/42.
По трем основным оценочным параметрам – вооружению, маневренности и броневой защите – Pz.III существенно превосходил только Т-26. Над БТ-7 немецкая машина имела преимущество в броневой защите, над Т-28 и КВ – в маневренности. По всем трем параметрам немецкий средний танк уступал только Т-34. Вместе с тем Pz.III имел неоспоримое превосходство над всеми советскими танками в количестве и качестве приборов наблюдения, качестве прицелов, надежности двигателя, трансмиссии и ходовой части. Немаловажным преимуществом было стопроцентное разделение труда членов экипажа, чего не было на большинстве советских танков. Последние обстоятельства, при отсутствии ярко выраженного превосходства в ТТХ в целом, позволяли Pz.III в большинстве случаев выходить победителем из танковых дуэлей. Впрочем, при встречах с Т-34, а тем более с КВ, добиться этого было весьма трудно: пробить их броню немецкая 50-мм пушка могла только с очень малой дистанции – не более 300 м.
К концу 1941 г. потери в машинах этого типа на Восточном фронте составили 660 единиц, а за первые два месяца 1942-го -еще 338! Тем не менее, в течение всего 1942 г. Pz.III оставались основной ударной силой Панцерваффе, в том числе и в ходе масштабных наступательных операций на южном фланге Восточного фронта, 23 августа 1942 г. Pz.III Ausf.J из 14-го танкового корпуса первыми вышли к Волге севернее Сталинграда. В Сталинградской битве и битве за Кавказ Pz.III понесли наиболее серьезные потери. В этих сражениях участвовали танки, вооруженные обоими типами пушек – в 42 и 60 калибров. Использование длинноствольной 50-мм пушки позволило отодвинуть дистанцию огневого боя, например, с Т-34 почти до 500 м.
В 1943 г. основная нагрузка в противоборстве с советскими танками перешла к Pz.IV с длинноствольными 75-мм пушками, а Pz.III все чаще играли вспомогательную роль. Тем не менее, они еще составляли примерно половину танкового парка Вермахта на Восточном фронте. К лету 1943 г. в штат немецкой танковой дивизии входил танковый полк двухбатальонного состава. В первом батальоне "тройками" вооружалась одна рота, во втором – две. Всего в дивизии полагалось иметь 66 линейных танков этого типа.
В последний раз в значительных количествах Pz.III применялись в ходе операции "Цитадель". В танковых и моторизованных дивизиях Вермахта и войск СС к началу этой операции насчитывалось 109 танков с короткоствольными 50-мм пушками, 528 – с длинноствольными и 172 – с 75-мм орудиями. Кроме этих танков еще 56 машин имелось в 503-м и 505-м тяжелых танковых батальонах, 656-м полку истребителей танков и других частях. По немецким данным, в течение июля и августа 1943 г. было потеряно 385 Pz.III Всего же в течение года потери составили 2719 единиц, из которых 178 после ремонта вернули в строй.
К концу 1943 г. в связи с прекращением производства число Pz.III в частях первой линии резко сократилось. Значительное количество танков этого типа передали в различные учебные и резервные части. Они несли службу на второстепенных театрах военных действий, например, в Италии и на Балканах.