Течению наперекор

Для каждой из двух стадий развития зародыша, in vitro проводили реакцию присоединения к тРНК (в разных опытах) десяти различных аминокислот. Каждый раз в пробирке смешивали суммарную тРНК, клеточный сок, содержащий все синтетазы, но освобожденный от аминокислот и только одну из девяти выбранных аминокислот. Причем радиоактивно меченную! Инкубировали при 37°С в течение 40 минут. Присоединяясь к «своим» изоакцепторным тРНК, эта меченая аминокислота «метила» и тРНК. Так что по радиоактивностям фракций, выходящих из хроматографической колонки, можно было построить «пики» или, лучше сказать, профили этих тРНК. Аминокислоты, присоединяющиеся к тРНК из 6-часовой стадии развития зародыша, метили радиоактивным тритием (³Н). А те же аминокислоты, садящиеся на тРНК из 12-часовой стадии, были помечены радиоактивным углеродом (¹⁴С). Продукты двух реакций присоединения одной и той же аминокислоты смешивали и вносили на специально подобранную для этой цели хроматографическую колонку. Число профилей на хроматограмме указывало число активных на данной стадии развития изоакцепторных тРНК для выбранной радиоактивно меченной аминокислоты. Современный счетчик радиоактивности позволяет в любой выходящей из колонки фракции измерять независимо радиоактивности трития и ¹⁴С-углерода. Условия хроматографического разделения очевидно тождественны для обоих тРНК, взятых из разных стадий развития зародыша.

Если зародыши на двух сопоставляемых стадиях роста имеют одинаковые изоакцепторные тРНК для данной аминокислоты, то их профили, меченные разными изотопами, должны совпасть. Если же эти тРНК различаются числом или характером своей «миноризации», то профили должны разойтись.

Из девяти сопоставленных таким образом тРНК для двух стадий развития зародыша пять не обнаружили никаких различий — их профили точно совпадали. А для четырех тРНК наблюдалось явное расхождение профилей и даже различие в их числе. Что означало различие числа изоакцепторных, «работающих» тРНК на двух сопоставляемых стадиях роста. Наверное, не случайно для всех этих четырех аминокислот генетический код оказался сильно избыточным. В четверку вошли все три аминокислоты, которым соответствует по 6 кодонов, и одна, имеющая 4 кодона.

Эти результаты также свидетельствовали в пользу нашей гипотезы. Но и они еще не доказывали ее правильности.

Описанный этап длился тоже два года: 75-й и 76-й.

3-й этап. Решающий эксперимент

План был таков. Очистить от тРНК и аминокислот клеточный сок из 6-часовой стадии развития. В нем должны остаться все ферменты и информационные РНК, присутствующие на этой стадии. Далее осуществить два опыта. В первом из них к этой очищенной системе добавить полный набор 20-ти аминокислот, из которых хотя бы одна (все равно какая) была бы радиоактивно меченая, а также суммарную фракцию тРНК, очищенную из той же 6-часовой стадии развития зародыша. Провести синтез in vitro радиоактивно меченных белков (одной меченой аминокислоты для этого достаточно).

Во втором опыте проделать то же самое, но суммарную фракцию тРНК очистить из 12-часовой стадии и провести in vitro синтез радиоактивных белков в тех же условиях. В обоих случаях отобрать белковые фракции, куда войдут и новосинтезированные, радиоактивно меченные белки. Затем разделить их методом электрофореза в тождественных условиях — в параллельных «дорожках» на одной и той же пластине геля. Если во втором случае по сравнению с первым обнаружатся дополнительные белки, то это означает, что их синтез был стимулирован именно «поздним» набором тРНК. Ведь информационные РНК в обоих опытах одни и те же, взятые из 6-часовой стадии роста.

Для постановки этих опытов было необходимо, во-первых, найти и оптимизировать условия осуществления синтеза полноценных белков in vitro в описанных выше условиях. Во-вторых, освоить и оптимизировать для наших объектов метод электрофореза в геле, позволяющий разделять большое число белков. В-третьих, отработать оптимальные условия регистрации полученного разделения белков на рентгеновской пленке. Все это заняло около двух лет. Наконец, все методики были отработаны и «решающий эксперимент» поставлен и повторен. Были получены четкие, воспроизводимые картины электрофореза белков, синтезированных in vitro для двух сопоставляемых условий эксперимента, отличающихся только использованными комплектами тРНК — из 6-часовой и из 12-часовой стадий развития зародыша вьюна. На рентгеновской пленке были ясно видны две соседствующие дорожки. В каждой из них зафиксировано порядка ста полос, отвечающих отдельным радиоактивно меченным белкам.