Экипаж летчика-испытателя В. Ф. Ковалева 5 ноября 1955 года поднял первый серийный Ту-104 в воздух, за ним последовали еще две машины нулевой серии, к маю 1956 года эти машины были готовы к эксплуатационным испытаниям. В августе 1956 готова была готова первая машина головной серии, ее поднимал в воздух и проводил заводские испытания летчик-испытатель серийного завода Ф. Ф. Доценко. Началось полномасштабное производство Ту-104.
Государственные испытания первая опытная машина проходила в НИИ ВВС с 31 января по 15 июня 1956 года. Государственные испытания проводил экипаж во главе с А. К. Стариковым, до этого с успехом проведшим испытания Ту-16 и сделавшим очень много для того, чтобы и его пассажирский младший брат «встал на крыло». На испытаниях был проведен большой объем полетов, связанных с аварийными ситуациями: отказ одного из двигателей на взлете, аварийный слив топлива в полете, прерванный взлет, экстренное снижение с больших высот, определение характеристик срыва, проверка эффективности противообледенительных и других систем.
В ходе государственных испытаний 22 марта 1956 года опытный Ту-104 совершил полет в Лондон с председателем КГБ И. А. Серовым и группой дипломатических работников, готовивших визит Н. С. Хрущева и Н. А. Булганина в Англию.
Появление Ту-104 на Западе вызвало огромный интерес с оттенками паники в авиационных и иных кругах по ту сторону «железного занавеса». Западу стало ясно, что СССР не только освоил сложнейшие технологии в области самолетостроения, но по ряду важнейших направлений ушел далеко вперед и способен производить не только небольшие современные истребители (с ними потенциальный противник не так давно тесно познакомился в Корее), но может создавать и первоклассные пассажирские реактивные машины, а значит, уже производит современные реактивные бомбардировщики с большой грузоподъемностью.
Некоторые английские издания, традиционно стремясь затушевать успех Советского Союза, напечатали сообщения, что в Хитроу приземлился единственный самолет подобного типа, имеющийся у Советов. О дезинформации было доложено Хрущеву. Никита Сергеевич спросил:
— А сколько их у нас есть?
Было доложено, что построено еще четыре машины, из них две с необорудованными салонами.
— Давайте еще две сюда, — распорядился Хрущев, — надо заткнуть им пасть!
Эксплуатационные испытания первых двух серийных самолетов начались практически одновременно с проведением государственных испытаний опытного самолета. Эксплуатационные испытания проводились силами ГВФ при помощи Министерства авиационной промышленности, в них участвовали от ОКБ ведущие инженеры Б. Н. Гроздов и В. Н. Бендеров.
Пионером освоения Ту-104 в ГВФ стало специально организованное в столичном аэропорту Внуково авиаподразделение реактивных самолетов. Оно являлось также первым учебно-тренировочным подразделением, в котором переучивались на новую реактивную технику экипажи других авиапредприятий. Среди пионеров реактивной пассажирской авиации были такие летчики первого класса, как К. П. Сапелкин, Е. П. Барабаш, Б. П. Бугаев, А. В. Орловец, первыми освоившими в ГВФ Ту-104 и принимавшие участие в эксплуатационных испытаниях.
Свой первый регулярный рейс Ту-104 с пассажирами по трассе Москва — Иркутск совершил 15 сентября 1956 года, самолет пилотировал экипаж командира корабля Е. П. Барабаша. 12 октября состоялся первый регулярный международный рейс в Прагу — командир корабля Б. П. Бугаев (будущий шеф-пилот Л. И. Брежнева, а затем министр гражданской авиации — руководитель советского ГВФ, маршал авиации). Началась регулярная эксплуатация самолета, открывшая новую эру не только в развитии отечественной гражданской авиации, но и ставшая явлением мировой реактивной пассажирской авиации. Ту-104 стал первым в мире реактивным пассажирским самолетом, успешно освоенным ГВФ, именно за ним в строй гражданской авиации встали и «Боинг-707» («Boeing 707»), и английская «Комета-4», и французская «Каравелла» («Caravelle»). Реактивная пассажирская авиация стала реальностью, доступной самому широкому кругу пассажиров.
Вслед за серийным производством Ту-104 на Харьковском авиационном заводе серия была развернута на заводе № 166 в Омске. С 1957 года оба завода перешли на 70-местную модификацию Ту-104А. В 1958 году к серийному производству Ту-104 подключился завод № 22 в Казани, который освоил 100-местный Ту-104Б. Всего до прекращения выпуска в 1960 году три завода построили 201 машину. Шесть самолетов Ту-104А были поставлены в ЧССР.
За создание самолета Ту-104 в 1957 году генеральный конструктор (должность введена решением Совмина в декабре 1956 года) А. Н. Туполев, ряд его заместителей и ведущих специалистов ОКБ: А. А. Архангельский, Н. И. Базенков, Д. С. Марков, С. М. Егер, А. Р. Бонин, А. Э. Стерлин, Л. Л. Кербер, К. В. Минкнер, А. М. Черемухин — были удостоены Ленинской премии. Более четырехсот работников ОКБ и опытного завода были награждены орденами и медалями, практически в полном составе премированы материально.