Вирус, который сломал планету. Почему SARS-CoV-2 такой особенный и что нам с ним делать

Участок для копирования внимательно выбирают так, чтобы он присутствовал только в геноме вируса: так как фрагмент небольшой, может случайно получиться, что очень похожий кусочек будет и в ДНК хозяина. Кроме того, этот фрагмент должен быть достаточно консервативен, чтобы не мутировать каждые пять минут, и при этом отличаться от аналогичных мест в геномах вирусов-родственников. Для того чтобы все получилось и размножились только нужные нам участки, очень важно правильно подобрать праймеры. Они могут плохо липнуть к желаемому участку или прилипать не только к нему, но и к какому-нибудь месту в геноме хозяина или других коронавирусов, и тогда полимераза будет умножать его, а тест — давать ложноположительный ответ. Важен и размер праймеров: слишком короткие будут неизбирательно приставать ко множеству неправильных мест, а специфичные, но слишком длинные могут частично приклеиваться к неправильному участку ДНК — и этого участка будет достаточно, чтобы полимераза начала синтез. В общем, подбор удачного фрагмента и праймеров — тонкое дело, и найти удачную комбинацию удается не всегда. Обычно останавливаются на отрезках, кодирующих какие-нибудь важные сервисные белки, которые обеспечивают собственные нужды вируса. И чаще всего тест-системы выявляют фрагмент не одного белка, а нескольких — такой дизайн практически исключает вероятность кросс-реактивности с похожими вирусами. Тест-системы на SARS-CoV-2 обычно выявляют кусочки генов N- и S-белков.

Если в соскобе с глотки есть вирусная РНК, после того как ученые выделят нуклеиновые кислоты, добавят праймеры и полимеразу и много раз проведут реакцию копирования, в пробирке накопится изрядное количество тех самых заранее выбранных кусочков вирусного генома, и их можно будет детектировать. Если же образец чист, полимераза не сможет ничего размножить, так как праймерам, указывающим ей участок, который нужно копировать, будет некуда приклеиться.

Выше я очень упрощенно описала принцип полимеразной цепной реакции, на которой основан генетический тест на коронавирус — и на многие другие вирусы. Но в случае с SARS-CoV-2 есть еще одна проблема: его геном записан на молекуле РНК, а ПЦР можно проводить только с молекулами ДНК. Поэтому на первой стадии теста выбранный фрагмент РНК превращают в ДНК, используя фермент обратную транскриптазу, или РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Изначально этот фермент тоже был выделен из вирусов. Конкретно — из ретровирусов, которым он необходим, чтобы перевести свой РНК-геном на язык ДНК и встроить в геном клетки-хозяина (на всякий случай, еще раз: SARS-CoV-2 так делать не умеет!). РНК-зависимая ДНК-полимераза садится на нить РНК и строит ее ДНК-копию. Место посадки ферменту опять же указывают праймеры.

Но и это еще не все. Полностью реакция, которую проводят при генетическом тесте на коронавирус, называется ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Такой тип исследования позволяет увидеть, на каком именно цикле умножения ДНК-копий появляется сигнал. По этому параметру можно приблизительно оценить исходное количество РНК в образце, и, главное, результат анализа виден сразу. При проведении классической ПЦР требуется еще один шаг для визуализации размноженных ДНК-фрагментов.

Итак, генетический тест на коронавирус основан на полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Схема всех шагов приведена на рисунке 10. Если сократить описание до одного предложения, получится следующее: ученые проверяют, есть ли в исследуемом образце фрагменты генов вирусных белков. То есть положительный результат генетического теста не говорит, что в глотке человека или в смыве с какой-то поверхности присутствует активный живой вирус, — наличие сигнала свидетельствует лишь, что в образце имеется вирусная РНК. Делать вывод о заразности человека или поверхности только по результатам ПЦР-теста нельзя: вирус может быть давно мертвым или же его количество недостаточно для передачи (мы подробно обсуждали этот вопрос в главе «Как передается коронавирус», но еще вернемся к нему в этой и следующих главах). Чтобы судить о возможной заразности, необходимо проводить длительные эксперименты в лаборатории класса BSL-3: добавить полученный образец к культурам клеток и посмотреть, произойдет ли инфицирование. И даже если клетки заразятся, нельзя однозначно утверждать, что такого количества вируса достаточно для заражения людей.