Козимо признал членом своей фамилии Джаи-Джакомо Медикини из боковой ветви рода Медичи и помог его брату получить папский престол под именем Пия IV (1499–1559—1565). Этот сомнительный Медичи в миру носил имя Джованни Анджело Медикини и происходил из Миланского герцогства. Он считался человеком ясной и спокойной души, полной радости жизни и благожелательности. Контраст с его суровым предшественником склонил кардиналов на его сторону. Это расхожее суждение плохо согласуется с той безжалостностью, с которой он отнесся к непотам Павла IV. Кардинала Альфонсо Пий приказал отправить в ссылку, Джованни был приговорен к публичной казни, а кардинала Карло Фарнезе, голосовавшего за него на конклаве, папа приказал задушить в тюрьме. Сам он был отцом четырех внебрачных детей и обеспечил им выгодные бенефиции; сыновьям трех своих сестер пожаловал кардинальские шапки.
Известность Пий получил, в основном, как вдохновитель Тридентского собора. Этот собор был первым четким ответом Реформации со стороны Римской церкви. Решения, принятые собором, подтверждали общую верховную власть церкви над христианством, но публично не оспаривали право суверенных государств применять собственные законы как в светских, так и в религиозных делах. Вместе с тем эти решения не ограничивали власть папы, отдавая под его опеку осуществление реформ церкви. Тезисы о верховенстве Собора над папой были на долгое время отодвинуты в тень. Были преданы осуждению идеи Лютера и Кальвина и сформулированы главные принципы католической доктрины о таинствах, о милосердии Божьем и о роли церкви в спасении человечества от греха. Постановления Тридентского собора были с возмущением восприняты в Европе, особенно в протестантских странах.
Учения Реформации продолжали распространяться, и с ними по большей части Европы множились гонения и сожжение на кострах тех, кто католик ли, протестант ли, имел несчастье оказаться в несогласном меньшинстве.
В 1564 году появился обновленный, исправленный и дополненный зловещий «Индекс запрещенных книг».
Однако в разразившиеся тогда в Европе религиозные войны Пий не вмешивался.
Из дружбы с императором Козимо извлек немалую пользу: имперцы не дали ему захватить Лукку, но согласились на захват Флоренцией Сиены. Тем самым под властью герцога оказалась вся Тоскана, и в 1569 году он получил от нового папы Антонио Гислиери — Пия V (1504–1566—1572), всегда солидарного с Мадридом, титул Великого герцога Тосканского (ранее он носил лишь титул Великого герцога Флорентийского). Папа Пий V, непримиримый враг еретиков, возвел Козимо в этот высокий ранг, желая вознаградить его за его военные кампании во Франции и успешные действия пизанских галер в Средиземном море против турецких пиратов.
Франция только через год признала этот титул, и то лишь благодаря доброжелательности кузины Козимо, Екатерины Медичи.
В действительности Тоскана была государством с ограниченным суверенитетом, со стороны моря опоясанным испанскими военными укреплениями. Это вынуждало герцога проводить осторожную политику, лавируя между Мадридом и Парижем. Однако в Европе Тоскану не рассматривали как равноправного игрока на политической сцене; о Флоренции с восхищением говорили, в основпом, как о городе-сокровищнице. И в этом не было преувеличения: ее кладовые были не только вновь полны, но и постоянно пополнялись.
В 1545 году от Франциска I вернулся Бенвенуто Челлини и приступил к созданию знаменитого «Персея».
Осознание того, что он смог воссоздать, хотя бы отчасти, древнюю Этрурию, направило герцога на путь изучения античности, к чему ранее он был не особенно склонен. Благодаря этому проснувшемуся интересу к коллекции Медичи были добавлены новые сокровища, такие как «Химера из Ареццо» или статуя Авла Метелла («Оратор»), один из самых знаменитых шедевров античности.
Коллекционер антиквариата, блестящий знаток алхимии и астрологии, герцог избрал своим зодиакальным знаком-символом Козерог, который принадлежал его предку Лоренцо Великолепномуо, императору Августу и Карлу V. Поэтому этот знак постоянно появляется в декорациях палаццо Веккио.
От представителей старшей линии рода его отличали жестокость, формализм и бесчувственность. Однако, следуя традициям семьи, он поддерживал литературу и искусства. Тем не менее, верный семейным преданиям, Козимо покровительствовал просвещению и реставрировал Университет в Пизе.
Под его патронатом были возведены палаццо Питги, в котором он жил и которое оставалось резиденцией правящего дома Тосканы до пресечения их рода, и мост Три-нита. Герцог начал осушение заболоченных равнин, в том числе и удаленных от города. По мере появления новых территорий происходило их заселение.