При Иване Грозном в городе начинается строительство каменного детинца — кремля и собора. Идея превращения этого крупного торгово-ремесленного центра Севера, стоящего на путях к Белому морю, в сильную крепость объясняется внутригосударственной политикой Ивана Грозного. Стремясь ликвидировать последние остатки политической раздробленности, он устанавливает в 1565 году опричнину. В этот выделенный и обособленный «государев удел» среди прочих городов была включена и Вологда.
Вероятно, царь задумал создать здесь большой архитектурный комплекс типа кремля, превратив его в свою северную резиденцию. Уже в первый свой объезд новых «опричных» владений в конце 1565 года Иван Грозный «
Кремль возводили не в районе старого центра Вологды, возле «Ленивой площадки», а на новом месте, стратегически более выигрышном, — ниже по течению реки, при впадении в нее речушки Золотухи. Всеми градостроительными работами руководил один из выдающихся русских инженеров XVI века (согласно летописи «родом литвин») Размысл Петров, зарекомендовавший себя еще при взятии Казани. Одновременно шло сооружение огромного каменного городского собора.
Разразившаяся по всей Руси в 1571 году эпидемия — «мор велик», докатилась и до Вологды. Иван Грозный спешно отбыл в столицу. По образному выражению местного летописца, «того ради великий государь изволил итти в царствующий град Москву, и тогда Вологды строение преста». Последовавшая вскоре ликвидация опричнины, очевидно, изменила замыслы Грозного в отношении Вологды. Кремль так и остался недостроенным.
Местные легенды и предания по-своему объясняют быстрый и неожиданный отъезд царя из Вологды. Народная фантазия окружила реальные события многими вымышленными, но удивительно красочными поэтическими подробностями, приписав отъезд «несчастливому» осмотру Грозным нового собора. Вот как об этом повествует одна из старинных песен.
К XVI веку Вологда становится также крупнейшим церковно-духовным центром Севера. Здесь ведется обширное летописание, составляются жития святых, записываются различные сказания и т. д. В начале века при дворе епископа Филофея была создана Вологодско-Пермская летопись, содержащая одну из древнейших редакций выдающегося произведения — «Сказания о Мамаевом побоище» — и особую редакцию «Повести о стоянии на Угре» в 1480 году. Основанная еще в 1492 году, в противовес новгородской епископии, Вологодско-Пермская епархия в «опричные» годы принимает «под свое крыло» Двину, Вагу и Каргополь, распространяя свою власть на громадную территорию.
Следующий период истории Вологды связан с событиями польско-шведской интервенции. До 1608 года из города посылались деньги и ратные люди «московскому воинству», но когда чужеземцы появились под его стенами, жители города стали непосредственными участниками военных событий. Вражеские отряды периодически грабили, жгли, разоряли посады, города и окрестные села. В первый раз поляки захватили Вологду в результате измены воеводы.
Однако население города, «схватив воеводу и дьяка Ковернева, всех поляков и пленных, отрубили им головы и трупы бросили в реку Золотуху, где их пожирали свиньи и собаки».