Протестантская уния, искавшая поддержку вне страны, стремилась в 1609—1611 гг. использовать в своих интересах начавшееся в Чехии движение против Габсбургов. Тогда же сделаны были Протестантской унией попытки сближения с Венецианской республикой, со швейцарскими кантонами и с Англией. В 1613 г. подписан был оборонительный союз унии с Голландией.
В это время в католическом лагере не только углублялась борьба между австрийским и баварским домами, но и обнаружилось глубокое недовольство мелких швабских и баварских феодалов, средства которых стремились присваивать себе руководители Католической лиги. Перспектива победы протестантов испугала, однако, духовных феодалов Юго-Западной Германии, которые опасались проведения у них секуляризации. Максимилиан Баварский воспользовался этим для укрепления лиги и сохранения в своих руках управления ею. В 1614—1615 гг. лига выступает активно в ряде конфликтов протестантов с католиками — в герцогстве Юлих, графстве Клеве, в городах Ахене и Мюльгейме и в других пунктах Рейнской области, расправляясь всюду с протестантами. Иезуиты старались с помощью папы обеспечить своему ставленнику Фердинанду Штирийскому наследование престола в Австрии, Чехии, Венгрии и права на корону «Священной Римской империи». Матвей объявил Фердинанда своим наследником.
Фердинанд Штирийский начал открыто нарушать «Грамоту величества» и все гарантированные ею чехам политические и религиозные права. В Чехии стали преследовать протестантов и сторонников политической самостоятельности страны, в том числе и командовавшего чешским войском графа Турна. Для проведения мероприятий, задуманных Габсбургами, в Праге было составлено правительство из десяти «заместителей» («лейтенантов»), противников «Грамоты величества», которые не признавали чешских «дефензоров» и подвергали их репрессиям.
Эти реакционные меры Фердинанда и его «лейтенантов» вызвали в Чехии большое возмущение. Во всех слоях общества росла решимость к сопротивлению. Протестантские депутаты чешского сейма собрались 5 мая 1618 г. для выражения резкого протеста императору Матвею против нарушения «Грамоты величества». Когда же Матвей не только грубо отклонил протест, но и объявил выступавших на протестантской ассамблее бунтовщиками, подлежащими наказанию, это вызвало возмущение жителей Праги. В городе собирались вооружённые толпы людей, обсуждавших королевские приказы и требовавших их отмены. Во время переговоров представителей чешского сейма с королевскими «лейтенантами» и их сторонниками из католической знати собравшаяся в Пражском кремле вооружённая толпа потребовала расправы со ставленниками Габсбургов. По старому чешскому обычаю расправы с предателями (получившему название «дефенестрации») двое из «лейтенантов» — Мартиниц и Славата — были выброшены из окна.
Первый (чешско-пфальцский) этап Тридцатилетней войны (1618—1624 гг.)
Открытая агрессия Габсбургов против Чехии, направленная на ликвидацию всех остатков прав чешского народа и на полное его подчинение, послужила началом Тридцатилетней войны (1618—1648 гг.). Акт «дефенестрации» 23 мая 1618 г. означал по существу разрыв Чехии с Австрией.
Чешский сейм избрал правительство из 30 директоров, установившее связи с протестантами Венгрии и Австрии и с главой Протестантской унии Фридрихом Пфальцским. Одновременно велись переговоры с моравским ландтагом о восстановлении государственного единства и образовании вместе с Силезией, Верхней и Нижней Лужицами конфедерации по образцу Северных Нидерландов. Идея воссоединения с Чехией пользовалась большим сочувствием в народных массах Моравии, и чешскому войску удалось занять крупнейшие моравские города. Командовавший в Моравии габсбургскими военными силами корыстолюбивый католический чешский магнат Альбрехт Валленштейн, являвшийся сторонником Австрии, был смещён моравским ландтагом. Чешскому правительству удалось укрепить свои собственные военные силы. В августе 1619 г. Фердинанд, незадолго перед коронованием его императором, был объявлен в Чехии низложенным. Ещё раньше из страны были изгнаны иезуиты.
Чешское выступление не вылилось в широкое национально-освободительное движение народных масс Чехии и Моравии. Длительная полоса феодальной и общей политической реакции ослабила силы чешского народа. Чешские дворяне не хотели опереться на народные массы. Свои надежды они возлагали на унию немецких протестантов, «помогавшую» им только обещаниями, и на наёмников, которых вербовал для них полководец унии — кондотьер граф Эрнст фон Мансфельд. Низложив Фердинанда, чешский сейм избрал королём Фридриха Пфальцского, не пользовавшегося популярностью в Чехии и к тому же не имевшего войск.