В 1794 году Серафим испросил благословения у преемника Пахомия, настоятеля Исаии, удалиться на пустынножительство в место, расположенное километрах в пяти от монастыря, в лесах реки Саровки. Еще несколько монахов тоже получили благословение на такую же отшельническую жизнь. Пожалуй, никакой другой период жизни Серафима так хорошо не известен, как это его пустынножительство. В течение каждой недели он прочитывал весь Новый Завет, совершая и все положенные службы суточного круга вдобавок к своему личному молитвенному правилу. Работал в своем огороде, колол дрова. Саровский лес сделался для него пустыней, иначе говоря – местом встречи с Богом и борьбы с самим собой. Разным местам в лесу он дал имена Назарета, Вифлеема, Гефсимании, Фавора и Иерусалима: это помогало ему читать Писание и молиться. Каждую субботу под вечер возвращался он в монастырь для участия во всенощном бдении и затем воскресной литургии, за которой непременно причащался. После этого он вновь отправлялся в свою пустыньку с недельным запасом хлеба; остальную его пищу составляли овощи с огорода и лесные растения. Известная литография изображает его кормящего хлебом громадного черного медведя. Павел Евдокимов указывает на эту черту, роднящую его с древними отцами-пустынниками и такими святыми, как Франциск Ассизский и Иероним. Животные и птицы чуют в святом изначальный аромат Рая, присутствие кого-то «весьма подобного» Самому Господу.
В лесу Серафим носил простую крестьянскую сорочку из грубой ткани. У него вошло в привычку одеваться, как крестьяне и рабочие того времени, носить зимой сапоги, а летом берестяные лапти. Тысячу дней и ночей в Саровском лесу простоял он в молитве на ногах или на коленях на огромном камне, как это изображается нередко на иконах, в частности на иконах о. Григория (Круга). Подобно отшельникам прошлого, он вел постоянную брань с духами зла. Как-то на Серафима напали трое разбойников, избили его до полусмерти. Вновь удостоился он, лежа почти на смертном одре, посещения Божией Матери с апостолами Петром и Иоанном, еще раз услышал Ее слова: «Сей от рода нашего»* и снова был чудесно исцелен. Шрамы от этого нападения никогда полностью не сошли с его тела. Он преждевременно состарился, волосы на голове и борода совершенно поседели, нанесенные увечья сделали его на всю оставшуюся жизнь сгорбленным, так что для хождения нужен была посох. Последние годы отшельничества он провел в безмолвии и уединении, более уже не возвращаясь в обитель по воскресеньям и праздникам.
Однако весной 1810 года совет старцев монастыря и новый настоятель велели ему вернуться в обитель. Получив это повеление, он возвратился, но образ его жизни в общине снова был далеким от обычного. Он стал отшельником в своей келье, внутри монастыря, решаясь лишь вечером выходить в храм; пищу и даже Святые Дары приносили ему в келью; он ни с кем не общался, и видеть его можно было лишь во время вечерних отлучек. Такое уединение, крайнее даже для монастырской жизни, продолжалось пять лет. Внезапно летом 1815 года, после тщетной попытки местного епископа посетить Серафима, двери его кельи отворились для молодой четы, местного губернатора и его супруги. С этого дня до самой его смерти 2 января 1833 года двери эти уже не закрывались, и его жизнь стала непрерывным служением духовника, молитвенника и целителя для тысяч людей, стекавшихся в Саров, православных и неправославных христиан со всей страны. Но и здесь можно отметить необычные черты. В келье святого всегда горели свечи как знак молитвы за многих посещавших и писавших ему. Он раздавал кусочки освященного хлеба, как бы повторяя насыщение Господом толпы умножением хлеба и рыб, как живое свидетельство евхаристического «хлеба жизни», по словам Павла Евдокимова.
Своими чудесными дарованиями Серафим охватил, кажется, и нынешнее время, и древнюю эпоху пустынных отцов. У Михаила Мантурова и Николая Мотовилова, которые стали близкими друзьями и помощниками батюшки, Серафим, по-видимому, распознал комплексные психосоматические причины их болезней. В обоих случаях он приступил к исцелению только после «терапевтической» беседы с ними, вызвав у них веру или, скорее, побудив их к исповеданию веры в то, что Бог способен их исцелить. Мотовилов, которому предстояло стать свидетелем теофанического откровения Серафима, получил от батюшки повеление, как некогда расслабленный от Господа, стать на парализованные ноги и ходить. Применяя в некотором смысле духовную терапию, Серафим проник сквозь все их возражения и защитные механизмы, подчеркивая, однако, что он лишь орудие, средство, через которое целительная сила Божия открывается в их страданиях. Как и в евангельских случаях, Мантуров и Мотовилов, получив исцеление, были сразу же привлечены к работе Серафимом, который хорошо знал святую силу труда. Они стали сотрудниками во многих делах Серафимова служения; в частности батюшка поручил им строительство мельницы и храмов в Дивеевском монастыре. В этом Мотовилов преуспел больше Мантурова.