Журнал «Компьютерра» № 9 от 7 марта 2006 года

В принципе, любую последовательность нуклеотидов можно синтезировать химически. Однако мы пока не можем сами придумать ген, определяющий нужные нам свойства. Зато мы можем попытаться найти живое существо, обладающее такими свойствами (в нашем случае – способность к флуоресценции), и выделить нужный ген из него. Для этих целей выберем морские кораллы. Обычно их окраска флуоресцентная: если в темноте посветить на живой коралловый риф синей лампочкой (например, из детектора валюты), он засияет всеми цветами радуги. Это светятся так называемые GFP-подобные белки, содержащиеся в кораллах, – среди них есть голубые, зеленые, желтые и красные. Наша задача заключается в выделении из коралла и подготовке к внедрению в мышь гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок.

Включаем центрифугу…

Для начала необходимо раздобыть живой коралл, убедиться, что под ультрафиолетовой лампой он светится (то есть содержит нужный нам белок), и выделить из него РНК. Как правило, поиск нового гена начинается именно с РНК – она не содержит ненужных нам некодирующих белок участков. Однако в работе с РНК есть свои сложности: в частности, она быстро разрушается специальными ферментами, обильно выделяемыми нашим организмом для защиты от вирусов. Поэтому заранее поставим одноразовые пластиковые пробирки на лед (при низкой температуре ферменты работают хуже) и наденем резиновые перчатки. Кроме пробирок нам понадобятся настольная центрифуга, несколько автоматических пипеток с одноразовыми наконечниками и набор реактивов для выделения РНК.

Аккуратно отщипываем от коралла маленький (чуть больше спичечной головки) кусочек ткани и помещаем в пробирку. В нее же наливаем реагент для разрушения ткани и начинаем теребить кусочек коралла пипеткой. Все надо делать быстро, иначе РНК успеет развалиться. Когда большая часть ткани растворится, начинаем крутить пробирку в центрифуге. Осадок трогать не станем, отберем только жидкость и перенесем ее в другую пробирку.

Теперь мы имеем раствор, в котором содержатся белки, ДНК, РНК и масса других компонентов. Из всей этой смеси нам нужна только РНК. Для разделения (фракционирования) разных классов биологических молекул используется, как правило, изменение их растворимости – например, если добавить в наш раствор спирта и немного соли, большая часть ДНК и РНК выпадут в осадок. Еще раз «прокрутив» пробирку на центрифуге и удалив жидкость, мы получим обогащенный РНК образец. Эту процедуру придется повторять несколько раз, добавляя в смесь разные вещества; в итоге мы избавимся от большинства примесей и получим относительно чистый раствор молекул РНК, часть которых, как мы надеемся, кодирует нужный нам белок.

Для дальнейшей работы уже недостаточно физико-химических методов. Тонкие операции с биологическими молекулами мы будем проводить, используя инструментарий, позаимствованный у природы, а именно ферменты.

В молекулярной биологии применяется множество ферментов, выделенных из разных организмов, – если их поместить в подходящий по составу солевой раствор и добавить все необходимые для реакции компоненты, ферменты заработают в пробирке так же, как и внутри клетки. Выделять нужные ферменты нам не придется, все они продаются специализированными компаниями.

Ревертаза

Теперь на основе каждой молекулы РНК мы должны синтезировать соответствующую ей (комплиментарную) молекулу ДНК (кДНК). ДНК более стабильна, а главное, для работы с нею существует гораздо больше методов. Правда, большинство живых существ не умеет строить ДНК по РНК (наоборот, ДНК является матрицей, с которой обычно синтезируется РНК), однако из этого правила есть исключения. Так называемые ретровирусы (к ним относится, например, ВИЧ – вирус, вызывающий СПИД) почему-то выбрали именно РНК для хранения своей наследственной информации. Для размножения ретровирус должен встроить свои гены в геном жертвы, поэтому с вирусной РНК должна сперва считаться ДНК-копия. Такая реакция называется обратной транскрипцией. Ретровирусы «изобрели» для нее специальный фермент, ревертазу, чем сильно поспособствовали прогрессу молекулярной биологии.

Для работы ревертазе требуется так называемая затравка – короткий фрагмент ДНК, заранее прикрепленный к молекуле РНК. Когда ревертаза натыкается на затравку, она «садится» на РНК и ползет по ней в направлении от конца к началу молекулы. При этом ревертаза захватывает из раствора отдельные нуклеотиды и присоединяет их к затравке, тем самым удлиняя цепочку ДНК. РНК при этом играет роль матрицы.

Праймеры

Синтез кДНК мы проведем с помощью набора реактивов SMART, выпускаемого фирмой Clontech (США). Кроме ревертазы и солевого буфера, в котором этот фермент работает, в набор входят также два коротких (длиной около пятидесяти нуклеотидов) фрагмента одноцепочечной ДНК – праймеры. Каждая цепочка синтезированной нами кДНК будет начинаться с одного из этих праймеров и заканчиваться последовательностью нуклеотидов второго праймера. Для чего это нужно, мы скоро узнаем.