Журнал «Компьютерра» № 9 от 7 марта 2006 года

Так же, как в только что использованной нами реакции обратной транскрипции, основным компонентом ПЦР является фермент – выделенная из бактерий, живущих в горячих источниках, термостабильная ДНК-полимераза. Подобно ревертазе, ДНК-полимераза синтезирует молекулу ДНК, присоединяя отдельные нуклеотиды к затравке комплиментарно матрице, только в качестве матрицы на сей раз используется ДНК, а не РНК. ДНК-полимеразы есть у всех животных (собственно, они необходимы для удвоения ДНК при делении клеток), особенностью же термостабильной полимеразы является ее способность работать при высокой температуре.

…и амплификатор

Для проведения полимеразной цепной реакции добавим к одноцепочечной кДНК полимеразу, оптимизированный для ее работы солевой буфер, смесь нуклеотидов и два праймера, соответствующих добавленным на концы кДНК адаптерам. Теперь нам понадобится специальная лабораторная установка – амплификатор. Несмотря на свою дороговизну (а стоит такой прибор как автомобиль) амплификатор представляет собой всего лишь хороший программируемый термостат, способный быстро менять температуру. Ставим пробирку в амплификатор и запускаем программу: прибор должен сначала прогреть раствор до 95 °С, затем снизить температуру до 60 °С, затем подержать пару минут 72 °С и начать все с начала. В принципе, вместо амплификатора можно использовать три термоса с подогретой водой – раньше так и делали, только рука устает пробирку переносить. Давайте теперь посмотрим, что же будет происходить в нашей смеси.

При температуре 95 °С цепочки ДНК и РНК отходят друг от друга. РНК нас больше не интересует, скорее всего она развалится в ближайшее время. Когда температура опускается до 60 °С, один из праймеров прилипает к соответствующей ему нуклеотидной последовательности адаптера на конце молекулы ДНК. При последующем повышении температуры до 72 °С начинает работать термостабильная ДНК-полимераза – мы как раз достигли оптимальной для этого фермента температуры. Полимераза «садится» на прилипший праймер и, перемещаясь по молекуле, начинает присоединять к ней нуклеотиды.

За первый цикл полимеразной цепной реакции ДНК-полимераза построила комплиментарные цепи для каждой одноцепочечной молекулы кДНК, находящейся в реакционной смеси. Теперь мы получили полноценную двухцепочечную ДНК, но завершать реакцию пока рано – нам необходимо наработать больше материала. ПЦР продолжается: 95 °С – цепи ДНК расходятся; 60 °С – праймеры садятся на ДНК; 72 °С – полимераза достраивает праймеры, превращая их в новые цепи ДНК. За каждый цикл количество ДНК в пробирке удваивается; таким образом, за двадцать циклов ПЦР для каждой молекулы ДНК мы получаем 220 точных копий. Вся работа заняла около часа, ксероксам подобные скорости и не снились. Итак, мы имеем достаточно ДНК, а главное, всегда сможем дополнительно ее амплифицировать, проведя еще одну полимеразную цепную реакцию.

Векторные плазмиды

Теперь в нашей пробирке плавает не меньше миллиона копий гена зеленого флуоресцентного белка. Однако в том же растворе находятся еще миллиарды копий других молекул ДНК, и нам надо как-то «отделить зерна от плевел». Мы уже знаем, что физико-химические методы здесь не годятся: разные молекулы ДНК слишком похожи друг на друга. Для поиска гена зеленого флуоресцентного белка мы воспользуемся главным свойством именно этого белка – флуоресценцией.

Все имеющиеся в растворе гены коралла мы введем в бактерии так, чтобы каждая из них получила один ген. Бактерии в норме «не умеют» флуоресцировать – если мы найдем флуоресцентную бактерию, значит, внутри нее работает (экспрессируется) ген флуоресцентного белка из коралла. Молекулярные биологи часто используют в своих целях лабораторные штаммы кишечной палочки E. coli (эти бактерии относительно безопасны для человека, какое-то их количество всегда присутствует в нашем кишечнике).

Отличительной чертой бактерий является то, что часть генетической информации у них содержится в коротких кольцевых молекулах ДНК – плазмидах. Многие биотехнологические компании торгуют очищенными плазмидами (векторами), специально предназначенными для решения разных молекулярно-технологических задач. Нам необходимо купить или попросить у знакомых биологов вектор для экспрессии чужеродных генов в бактериях, вставить в него нашу кДНК и перенести полученную конструкцию в бактерию.

Рестриктаза