Так, в 1699 году бунчужный товарищ Даниил Забила, договорившись с боярином Борисом Шереметьевым, написал царю о якобы имеющих место тайных сношениях гетмана с крымским ханом. Однако Петр не поверил и отправил доносчика в Батурин, где тот, после пыток, был приговорен генеральным судом к смертной казни, замененной гетманом на пожизненное заключение. Среди жалоб царю встречались и справедливые, касавшиеся своеволия и несправедливости гетмана, однако Петр I не считал нужным раздражать И. Мазепу мелочным вмешательством в его отношения с казацкой старшиной и закрывал глаза на эти сигналы.
В 1705 году гетман в очередной раз продемонстрировал Петру свою преданность, отправив ему письмо от шведского ставленника на польском престоле С. Лещинского, в котором тот убеждал Мазепу перейти на его сторону, обещая щедрое вознаграждение. После такой демонстрации верности царь уже не верил никаким доносам на И. Мазепу.
Однако в 1707 году гетману довелось пережить малоприятную историю, связанную как с интимной сферой его жизни, так и с политической карьерой. В 1702 году И. Мазепа овдовел. На его глазах созревала юная красавица, дочь генерального судьи Василия Кочубея Матрена, крестница гетмана. Мазепа покорил ее сердце и просил стать его женой, но родители девушки, мотивируя церковной недопустимостью брака крестного с крестницей, ответили отказом. В семье Кочубеев разразился скандал, и влюбленная девушка убежала к И. Мазепе. Чтобы не позорить девушку, гетман отправил ее к отцу, где ее жизнь теперь стала невыносимой. Матрена тайно писала Мазепе о своих страданиях и особенно об издевательствах своенравной матери, а он отвечал ей, что никого на свете еще не любил так, как ее, но понимая, какая беда выйдет, оставь он ее в своем доме, отправил ее к родителям. Послания с горькими упреками слал И. Мазепе В. Кочубей, в ответ гетман укорял его в попустительстве капризам жены и жестоком обращении с дочерью.
Разъяренный В. Кочубей, сговорившись со свояком, полтавским полковником Иваном Искрой, решил прибегнуть к испытанному способу выяснения отношений — доносу царю. Донос состоял из 33 пунктов, но при всей кажущейся обстоятельности ни один из них не содержал информации, доказывающей неверность И. Мазепы Москве. Из доноса следовало и без того понятное: в ставке пожилого гетмана ведутся разговоры о ходе Северной войны и взвешиваются шансы сторон на победу. При этом личный мотив доноса был очевиден.
Петр доносу не поверил и начал следствие против самих доносчиков. И. Искра под пытками признался, что на это дело его подбил В. Кочубей, а тот, не стерпев мук, сказал, что затеял все, желая отомстить, и показал царю связку писем И. Мазепы к его дочери. Тогда царь, сам не отягощенный предрассудками в амурных делах, велел обоих доносчиков передать гетману для казни по решению войскового суда. 14 июля Кочубей и Искра были публично казнены в присутствии И. Мазепы и его войска в военном лагере под Белой Церковью.
Но, как потом оказалось, И. Мазепа тайно, через своих старых знакомых в Варшаве, поддерживал связи с окружением С. Лещинского, а затем и с Карлом XII. Конспирация и интриги были настолько тонкими и умелыми, что доподлинно эту сторону деятельности гетмана восстановить невозможно. Несомненно, однако, что при неопределенности исхода Северной войны И. Мазепа, как всякий опытный политик на его месте, хотел подстраховаться и получить дивиденды при любом повороте событий. Он действовал не в интересах Петра или Карла, а в своих собственных, и потому, когда шведский король, выведя из борьбы Данию и Саксонию и утвердившись в Польше, все силы сосредоточил против России, И. Мазепа счел его шансы на победу более вероятными, чем у Петра. Переход на сторону предполагавшегося победителя позволял рассчитывать на создание (в стратегическом союзе со Швецией) независимой Украины по обе стороны Днепра под властью престарелого гетмана.
Видимо, никогда не будет точно установлено, избрал ли Карл XII свой маршрут в кампании 1708–1709 годов, заведомо полагаясь на поддержку со стороны гетмана, или же И. Мазепа окончательно решил перейти на его сторону ввиду начавшегося в середине сентября 1708 года, движения шведской армии в Украину. Вдогонку Карлу XII из Риги шел оснащенный артиллерией и большим количеством боеприпасов корпус генерала Левенгаупта, но в сражении при Лесной 28 сентября он был перехвачен и разбит.