Стремясь побыстрее воспользоваться плодами победы при Лесной и еще до конца 1708 года разбить основные силы шведов, Петр I приказал И. Мазепе с украинскими полками идти на соединение с русской армией к Стародубу. Однако тот медлил, ссылаясь на свою болезнь и другие осложняющие обстоятельства. Ему нужно было принять окончательное решение — с кем быть: с Петром или с Карлом, а исход войны опять становился неопределенным. Сохранение верности Петру гарантировало победу России и удержание Украины в ее составе, причем царь не скрывал намерения ввести тут новую, более отвечавшую принципам централизованного государства, форму управления. Этого опасались и запорожские казаки, в частности, близкий И. Мазепе атаман К. Гордиенко. К тому же, в любую минуту Петр мог узнать о тайном соглашении между гетманом и шведским королем. Переход Украины на сторону Швеции, казалось бы, перевешивал чашу весов победы на сторону Карла, а значит, и создания И. Мазепой самостоятельного украинского государства.
Царские войска приближались, приказы присоединиться к российской армии следовали один за другим. Тогда, после проходивших в глубокой тайне совещаний с самыми близкими людьми, среди которых особенно выделялся молодой, одаренный Филипп Орлик, Иван Мазепа, наконец, принял решение. 24 октября 1708 года с пятитысячным отрядом и вовлеченными в его план лицами из круга казацкой старшины он переправился через Десну и открыто пошел на соединение с Карлом, полагая, что на его призыв вступить в союз со шведами откликнется вся Украина. Официально переход на сторону Карла в воззвании к народу мотивировался невыносимостью царского гнета и попранием исконных вольностей и прав украинского казачества, что бесспорно соответствовало истине. Однако находившийся с войсками возле украинских границ Александр Меншиков немедленно предпринял упреждающие действия. Он быстро перекрыл переправы через Десну, чтобы не дать вслед за гетманом перейти на сторону Карла украинским полкам, и 28 октября издал манифест к украинскому народу. В нем он клеймил И. Мазепу как изменника, который сошелся со шведами для того, «чтобы украинскую землю закрепостить под польское господство и церкви Божии и монастыри отдать в унию». Это было ложью, но, тем не менее, цели достигало: народ готов был в это поверить.
Поступок И. Мазепы вызвал недоумение и растерянность не только простых людей, но и основной части казацкой старшины. Подобного поворота никто не ожидал. В то же время, А. Меншиков 2 ноября захватил гетманскую резиденцию Батурин, перебил население города (около 20 тысяч человек) и завладел запасами вооружения и продовольствия.
Через четыре дня в Глухове, в присутствии царских представителей состоялась казацкая рада с участием четырех полковников: стародубского — Скоропадского, черниговского — Полуботка, переяславского — Томары и нежинского — Жураховского. И. Мазепа был объявлен изменником и низложен, а вместо него гетманом избран стародубский полковник И. Скоропадский, который, не веря в успех предпринятого И. Мазепой шага, не откликнулся на присланный ему призыв перейти на сторону шведов и сохранил верность Петру.
12 ноября, выполняя царский приказ, украинское духовенство предало Ивана Мазепу анафеме. Отлучение от церкви грозило всем, кто последует за ним и перейдет на сторону шведов. Вскоре к Петру присоединились еще два полковника, ранее поддержавших И. Мазепу: миргородский Апостол и компанийский Галаган. Посмертно были реабилитированы Кочубей и Искра, их семьям возвратили владения и дали новые привилегии. Из Сибири возвратился С. Палий.
Вскоре, видя, что силы Карла невелики и помощи ему ждать неоткуда, тогда как в армию Петра прибывают все новые пополнения, от И. Мазепы отступились и те, кто поначалу поддержал его: генеральный судья Чуйкевич, генеральный есаул Максимович, лубенский полковник Зеленский и другие. Простой народ сохранял лояльность к Петру, опасаясь в случае неповиновения зверских расправ, подобных тем, что обрушились на жителей Батурина и его окрестностей.
Между тем, боевые действия продолжались. К концу 1708 года шведы, перейдя Десну, заняли район Прилуки — Гадяч — Ромны; российские войска расположились возле Сум, Богодухова и Ахтырки, прикрывая дорогу на Харьков. В Киеве также оставались верные Петру войска. С наступлением весны Карл придвинул свою армию к Полтаве, гарнизон которой оказал сопротивление. К. Гордиенко привел на помощь шведам часть запорожцев, а в это время российские войска совместно с казаками Галагана атаковали и уничтожили Сечь.
Положение Карла и Мазепы становилось все более тяжелым. 27 июня (8 июля) произошло решающее сражение под Полтавой, в ходе которого лично от И. Мазепы уже ничего не зависело.
Никольский собор в Киеве. Построен под покровительством И. Мазепы. 1690–1696 гг.