Николай Нилович — профессор Воронежского университета с 1918 года и заведующий хирургической клиникой, а с 1923 года — кафедрой топографической анатомии и оперативной хирургии медицинского факультета Московского университета, реорганизованного позже, в 1930 году, в 1-й Московский медицинский институт, где он до конца жизни руководил факультетской хирургической клиникой. В 1924 году Бурденко, став директором факультетской хирургической клиники, организовал при ней нейрохирургическое отделение, с 1929 года руководил нейрохирургической клиникой при Рентгеновском институте Наркомздрава, на базе которой в 1934 году был учрежден Центральный нейрохирургический институт (теперь Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко АМН России). В 1933 году Николаю Ниловичу Бурденко было присвоено звание заслуженного деятеля науки РСФСР, а в 1939 году — академика Академии наук СССР.
В 1936 году, принимая орден Ленина, Бурденко сказал: «Я провел всю свою жизнь среди бойцов. Несмотря на свою гражданскую одежду, я в душе боец. Я кровно связан с Армией, я отдаю все силы Армии и горжусь своей принадлежностью к ней. Мы, врачи, можем сохранить жизнь 97 процентам раненых. Мы надеемся, что смерть от раны явится исключением и останется смерть от несчастных случаев, и это то, о чем я мечтаю».
Начиная с 1937 года Бурденко — главный хирург-консультант Советской армии. В 1939–1940 годах под руководством Бурденкои Е.Н. Смирнова было составлено руководство «Материалы по военно-полевой хирургии». К созданию руководства было привлечено около 40 авторов. В этом труде были изложены санитарно-тактические основы хирургической помощи, учение о ранах, освещены вопросы специализированной помощи, очерчено понятие первичной обработки ран. Во время войны с Финляндией (1939–1940) Бурденко принимает непосредственное участие в организации медицинской помощи раненым на фронтах.
Одним из первых в Советском Союзе Николай Нилович ввел в практику клинической работы хирургию центральной и периферической нервной системы, всесторонне разрабатывал теорию и практику этой новой области хирургии. За работы по хирургии центральной и периферической нервной системы Николаю Ниловичу в 1941 году была присуждена Сталинская премия. В мае 1943 года ему присваивается звание Героя Социалистического Труда.
Во время Великой Отечественной войны Бурденко — главный хирург Советской армии (1941–1946), генерал-полковник медицинской службы (1944); член ВЦИК; депутат ВС СССР в 1937–1946 годах, лауреат Государственной премии СССР (1941). В 1944–1945 годах Николай Нилович Бурденко занимается углубленным изучением пенициллинотерапии при ранениях самых различных частей организма. По его инициативе были созданы бригады, и на различных этапах эвакуации было проведено тщательное наблюдение над действием пенициллина на инфекцию с тщательным бактериологическим контролем.
В 1942 году Бурденко был назначен членом Чрезвычайной Государственной комиссии по установлению и расследованию злодеяний немецко-фашистских войск. 30 июня 1944 года правительством была учреждена Академия медицинских наук по проекту, разработанному Бурденко. 14 ноября 1944 года он утвержден в звании действительного члена Академии медицинских наук и 20 декабря 1944 года на учредительной сессии академии был избран ее первым президентом (1944–1946 г.).