В 1859 году Лысенко окончил с медалью гимназию и поступил в Харьковский университет на естественно-научный факультет. Одновременно с ним туда же поступил и двоюродный брат Николая Витальевича Михаил Старицкий — будущий известный драматург, один из пропагандистов национального возрождения Украины и, кстати, биограф Лысенко. В Харькове Николай Витальевич проучился всего год. В некоторых изданиях высказывают версию о том, что он оказался замешан в деятельности каких-то либеральных студенческих кружков, которая пристально рассматривалась полицией как раз в 1860 году. Мол, именно поэтому ему пришлось срочно уехать из Харькова. Другие говорят, наоборот, о том, что Киевский университет был прогрессивнее Харьковского. Так или иначе, в 1860 году Николай Лысенко переводится на физико-математический факультет Киевского университета. На этом можно было бы закрыть харьковскую страницу биографии композитора, но это было бы не совсем правильным. Дело в том, что творчество Николая Лысенко впоследствии было исключительно тесно связано с Харьковом. Здесь музыкальная культура находилась на исключительно высоком уровне, работал оперный театр, так бы сказать, всероссийского значения, приезжали самые маститые музыканты. Именно поэтому многие лучшие произведения Лысенко впервые были представлены именно в Харькове и были восторженно встречены публикой. История творчества Николая Витальевича неотделима от Харькова и его оперного театра.
Наступали либеральные времена. Реформы Александра Освободителя взбудоражили общество, и особенно студентов. Ликвидация крепостного строя, другие преобразования подвигли многих прогрессивно настроенных украинцев задуматься и над вопросами национального возрождения. Лысенко же начинает активно агитировать за это возрождение. Оно станет делом всей его жизни. Своим друзьям он доказывал, что не только с народом, но и между собой необходимо говорить по-украински, сделать этот язык культурным. Как пишет Старицкий, «Николай меньше занимался этюдами, зато больше создавал в украинском духе». Уже тогда Лысенко создавал студенческие хоры и руководил ими. Он, конечно, стремился быть в курсе всех музыкальных новинок России и Запада, писал музыку к мелодраме Старицкого, собирал народные песни. Так, в 1861 году он побывал на Полтавщине у своего студенческого товарища Павла Чубинского (автора музыки современного украинского гимна) и вернулся в Киев с большой коллекцией песен. Этим собирательством народного мелоса Лысенко занимался всю жизнь, путешествовал по селам, принимал корреспонденцию со всех концов Украины, лично выслушивал бандуристов и кобзарей. Николай Витальевич оставил бесценный материал для фольклористики и этнографии Украины.
Университет Лысенко окончил в 1864 году, через год стал кандидатом естественных наук. На этом с науками было, собственно, покончено. Лысенко полностью посвящает себя музыке. На семейном совете было решено, что продолжать музыкальное образование лучше всего в Лейпцигской консерватории, куда он и поступил в 1867 году. Тогда в Лейпциге работали видные музыканты. Учителем композиции был Рихтер, фортепиано — Мошелес и Венцель, теории — Паперитц. Лысенко был признан ими одним из наиболее одаренных учеников, он усиленно осваивал классические основы музыки, преобразовывал в правильные классические композиции все те же украинские мелодии.
Летом 1868 года Николай Лысенко женился на Ольге О'Коннор. Осенью был напечатан первый выпуск обработок сорока украинских песен. (Это количество Лысенко сделал обычным для своих выпусков.) В этом же году по заказу западно-украинских меценатов композитор создал музыку к Шевченковому «Заповіту». Творчество Тараса Григорьевича вообще всегда вдохновляло отца новой украинской музыки — иначе и быть не могло. Так что «Заповіт» лишь начал цикл под названием «Музыка к Кобзарю», в который вошло более 80 вокально-инструментальных произведений. Последняя, седьмая серия цикла появилась в 1901 году.
Свое обучение в Лейпциге Николай Витальевич окончил с большим успехом в 1869 году. В Лейпциге кроме указанных произведений он создал увертюру на тему песни «Ой, запил, казак, запил», первую часть «Юношеской» симфонии, квартет и трио для струнных. Кстати, именно в Лейпциге появилось после Второй мировой войны первое полное собрание сочинений Николая Витальевича.
В Киеве Лысенко уже становится безусловным лидером музыкального мира Украины, которым и останется до самой смерти. Он с головой погружается в работу — пишет музыку и преподает, занимается общественной деятельностью. Говорят, что Лысенко оставил бы гораздо больше произведений, если бы меньше времени посвящал ученикам, организации различных обществ, хоров, учебных заведений, собирательству, да и семейным делам. Однажды сам композитор признался, что приходится сочинять только по ночам. С другой стороны, то, что он сделал для развития музыкального искусства в Украине, может быть, и даже наверняка, не менее ценно, чем произведения сами по себе.