В Саратове ученый не оставил своей работы. Он служил в статистическом управлении, собирал сведения по истории и этнографии губернии. Имея довольно много свободного времени, Костомаров продолжил писать своего «Богдана Хмельницкого», начал новую работу о внутреннем быте Московского государства XVI – XVII вв., совершал этнографические экскурсии, собирал народные песни и предания. За примерное поведение ему были разрешены отпуска в Крым и Петербург.
Весной 1859 г. Петербургский университет пригласил историка возглавить кафедру русской истории. Запрещение педагогической деятельности было снято, и в ноябре этого же года Костомаров как экстраординарный профессор университета приступил к чтению лекций. О его мастерстве лектора, о глубокой научности лекций и богатстве их фактического материала буквально с первых же дней среди студентов ходили легенды. Почти каждая лекция ученого заканчивалась овацией.
Его слушателями были не только студенты, но и коллеги, друзья-историки, писатели, художники. Многие из них, в том числе Т. Шевченко, Н. Чернышевский, Н. Добролюбов, И. Тургенев, В. Белозерский, П. Кулиш, Н. Ге, В. Стасов, А. Пыпин, собирались по вторникам у Костомарова дома, обсуждая вопросы истории и современности. Вместе с некоторыми бывшими членами Кирилло-Мефодиевского общества Николай Иванович учредил журнал «Основа», на страницах которого публиковались материалы, посвященные истории и культуре Украины. Некоторые свои работы напечатал в «Основе» и сам ученый («О федеративном начале Древней Руси», «Две русские народности», «Черты народной южнорусской истории» и др.).
Эти и другие произведения вызвали не только научные споры, но и прямые нападки представителей официальной историографии, обвинявших ученого в попытке «разложения отечества» и в «украинофильстве». Но Костомаров переживал все неприятности в себе и полностью погрузился в научную работу, стараясь не ввязываться в эти споры и не обращать внимания на обвинения. В то же время он продолжал выступать с публицистическими и историческими статьями, писать художественные произведения, читать лекции в университете.
После вызванного студенческими беспорядками 1861 г. закрытия Петербургского университета несколько профессоров, в том числе и Костомаров, устроили в Городской Думе систематические публичные лекции, известные как Вольный университет. Сам ученый читал лекции по древней истории Российского государства. Когда один из профессоров был уличен в неблагонадежности и выслан из столицы, студенческий комитет решил в качестве протеста прекратить лекции. Костомаров, не желая идти на поводу у толпы, отказался подчиниться этому решению. Но на следующей его лекции 8 марта 1862 г. поднятый публикой шум все же заставил его прервать чтение. Вскоре Николай Иванович, высоко ставивший честь ученого и гражданина, вышел из состава профессуры Петербургского университета.
В жизни Костомарова снова произошел крутой поворот, необходимо было искать, куда приложить силы и знания. Свой профессиональный долг и предназначение в жизни он видел только в продолжении избранного им пути в исторической науке. Ученый так и не смог вернуться к преподавательской деятельности – его политическая благонадежность вновь была под подозрением. В 1863 г. его приглашал на кафедру Киевский университет, а год спустя – Харьковский, но Костомаров по указанию Министерства народного просвещения отклонил все эти предложения. В дальнейшем он ограничился только литературной деятельностью, которая после закрытия «Основы» (1862 г.) вошла в более узкие рамки. Николай Иванович как бы охладел к современности, с головой уйдя в изучение прошлого, день и ночь напролет работая в библиотеках и архивах. Изнурительный труд часто приводил, как он сам писал, к «слуховым и зрительным галлюцинациям». К тому же резко ухудшилось здоровье: портилось зрение, участились головные боли, начали прогрессировать радикулит и артрит, не помогали даже излюбленные водные процедуры.
С 1861 по 1865 г. Костомаров написал и издал более 200 работ, среди которых такие крупные исследования, как «Северорусские народоправства», «Ливонская война», «Смутное время Московского государства», «Последние годы Речи Посполитой», «Руина», «Мазепа», три тома «Русской истории в жизнеописаниях ее главнейших деятелей», а также многочисленные повести, рассказы, очерки, исследования в области фольклора. Большую работу вел ученый и как член Археографической комиссии. Им были разысканы и обработаны многочисленные исторические документы, вошедшие в многотомное издание «Акты, относящиеся к истории Южной и Западной России». Н.И. Костомаров был также редактором трех выпусков «Памятников старинной русской литературы». Он подготовил к изданию и отредактировал произведения Т. Шевченко (1866 г.), участвовал в публикации «Русской исторической библиотеки», журнала «Вестник Европы», во многих исторических съездах.