В предвоенные годы адмирал Н. Г. Кузнецов обращал внимание всех служб Наркомата ВМФ, Главного морского штаба, Военно-морской академии и военно-морских училищ на изучение боевого опыта флотилий в Гражданскую войну и во время конфликта на КВЖД. К этому времени уже вышло несколько книг по изучению опыта военных действий речных флотилий. В 1927 году в серии «Библиотека командира» была издана монография А. Саковича «Речные и озерные флотилии», в которой освещалась тактика действий речных сил. В 1928 году в той же серии вышла книга К. Шильдбаха «Борьба на реках», в которой исследованы способы действий речных флотилий. Автор подробно высказал свое мнение о форсировании речных преград. Этой же проблеме была посвящена монография В. Булашева «Речные военные флотилии», вышедшая в 1934 году.
В 1939 году Главный морской штаб подготовил временное Наставление по боевой деятельности речных флотилий (НРФ-39), в котором изучались требования, предъявляемые к подготовке и ведению боевых действий речными силами.
Накануне Великой Отечественной войны в составе ВМФ уже имелись Амурская Краснознаменная военная флотилия (база Хабаровск), Дунайская военная флотилия (база Измаил), Пинская военная флотилия (база Пинск) и Каспийская военная флотилия (база Баку).
В первые же месяцы войны Наркомат ВМФ формирует Ладожскую военную флотилию (25 июня 1941 года), усиливает Чудскую и Днепровскую озерные флотилии (22 июня 1941 года), воссоздает Азовскую флотилию, вновь создает Ильменскую озерную флотилию (28 июля 1941 года), за ней Волжскую (27 октября 1941 года) и Беломорскую (2 августа 1941 года). Все русские реки и озера включатся в войну.
Ладожская военная флотилия обеспечивала перевозки грузов через Ладожское озеро для осажденного Ленинграда. Так родилась Дорога жизни (водная магистраль летом и ледовая — зимой), сыгравшая важную политическую и стратегическую роль в Великой Отечественной войне. Моряки переправили по Дороге жизни более 1 миллиона человек и доставили 1 миллион 690 тысяч тонн грузов.
Азовская флотилия формировалась за счет судов Черноморского и Азовского морских пароходств. Нарком ВМФ Н. Г. Кузнецов издал директиву от 5 июля 1941 года, в которой требовал быть готовыми по решению правительства к образованию Азовской флотилии, с главной базой в Мариуполе и с маневренными базами в Ейске, Ахтари, Керчи, Ростове и Азове. Задача флотилии — прикрыть плавание по Азовскому морю от авиации и мин. Для решения этой задачи были вьшелены суда Азовского пароходства: ледокол № 4, «Перванш», «Штурман», «Мариуполь», «Воинов». Черноморское морское пароходство направило в состав флотилии суда «Рот Фронт» и «Спартаковец», выделялся также СКР ТЩ «Севастополь».
Утром 22 июня 1941 года корабли Дунайской флотилии ответили сильным огнем на артиллерийские залпы с румынского берега. Потерь в кораблях и боевой технике в этот день не было.
Больше того, моряки-дунайцы перешли в наступление и высадили первые десанты на территории противника, овладев румынским побережьем Дуная на протяжении 70 километров. И только в связи с отходом наших войск корабли флотилии вынуждены были перебазироваться в Одессу. Отход прикрывали корабли Черноморского флота — лидер «Харьков» и эсминец «Бодрый». Через три дня резко осложнилась обстановка на юго-западном направлении, и нарком ВМФ Н. Г. Кузнецов отдал приказ о переброске кораблей Дунайской военной флотилии в район Херсонеса и Николаева, где они будут взаимодействовать с войсками Южного фронта.
Дунайская флотилия была сформирована в июне 1940 года во время освобождения Бессарабии и Южной Буковины. К началу войны в ее состав входили: дивизион мониторов (5 единиц), дивизион бронекатеров (22 единицы), отряд катеров-тральщиков (7 единиц), дивизия сторожевых катеров, авиаэскадрилья, 6 батарей береговой обороны, отдельный зенитный артиллерийский дивизион.