Затем, на удивительный, хотя и короткий период, забытая королева вышла на авансцену. Правление её сына вызвало такое недовольство, что поднялось вооружённое восстание против Карла и его ненавистных фламандских советников. У повстанцев не было лучшего оправдания, чем поддержать права королевы, Донны Хуаны, и попытаться освободить её, чтобы она получила свои монаршьи права. Повстанцы захватили Тордесильяс, и несчастная, замороченная королева сначала, казалось, пошла навстречу требованиям повстанцев. Передавали, что она сказала: «Шестнадцать лет меня обманывали и терзали. Почти двенадцать я заточена здесь в Тордесильясе». Регент, кардинал Адриан, сообщал Карлу: «Хуже всего то, что во всех своих действиях мятежники требуют вернуть власть королеве, нашей монаршей госпоже, которая в своём уме и вполне способна править, и этим самым они отказывают во власти вашему величеству. И на самом деле вряд ли справедливо называть их мятежниками, поскольку они выполняют её королевские распоряжения… Почти все должностные лица и слуги королевы… утверждают, что с её величеством поступили несправедливо, заточив её на четырнадцать лет под предлогом её безумия, тогда как всё это время она была совершенно нормальна, как во время своего замужества».
И всё же Хуана явно была так ослеплена и сбита с толку неожиданным поворотом событий, что она вряд ли знала, как действовать. Если сначала она выказала сочувствие повстанцам, в конце концов она от них отреклась.
После того, как повстанцы были разбиты при Вильяларе 23 апреля 1521 г., Хуана вернулась к своему погребению заживо в Тордесильяс, где и просуществовала ещё тридцать четыре года, не имея права даже выйти из дворца. «Так как в результате почестей, оказываемых ей во время моего отсутствия, она стала очень высокомерной, — сообщал Дения, — нам всем здесь с ней очень трудно». Она была всё так же безразлична к окружающему и не обращала внимания на свою внешность. Её дочь, Екатерина наконец покинула её, заточение с матерью не причинило ей, по-видимому, никакого вреда, и она вышла замуж за своего кузена, португальского короля Иоанна III. Хуана всё больше и больше погружалась в фантастический мир маниакальной депрессии. Даже утешение, предлагаемое религией, не могло больше успокоить или утихомирить её беспокойный дух. «В канун Рождества, — сообщает Дения, — когда в часовне шла Божественная служба, она пришла за инфантой (Екатериной), которая слушала мессу, и закричала, чтобы убрали алтарь и всё остальное». Её безразличие и даже враждебность к религии вызвало подозрение, что она, возможно, одержима дьяволом. Она сама говорила, что её окружают злые духи. Она рисовала привидение кота, который пожирал душу её матери, разрывал на куски тело её отца и только и ждал, чтобы разодрать и её тело. Святой иезуит Франсиско Борха нашёл Хуану в состоянии крайнего замешательства, когда навестил её в конце жизни.
Точная природа её болезни ставит историков в тупик. Некоторые утверждают, что она никогда не была сумасшедшей, а просто беззащитной жертвой жестокого обращения со стороны мужа, отца и даже сына. Другие считают, что она страдала от припадков шизофрении, но более вероятным кажется, что она была подвержена депрессии, которая в конце концов довела её до хронического маниакально-депрессивного психоза.
Она умерла на Страстную пятницу в 1555 г. на семьдесят шестом году жизни. После её смерти Карл сказал своему брату Фердинанду, что на смертном одре разум её прояснился, и она призвала своего Спасителя. Хотя Хуана никогда не пользовалась властью, на которую имела право как королева Испании, её помешательство повлекло неисчислимые последствия в мировой истории, так как именно оно дало возможность её сыну Карлу взойти на престол и править долго. Если бы Хуана была королевой Кастилии до своей смерти в 1555 г. (в этом году Карл отказался от императорского титула, а через год отрёкся от испанского престола), европейская история могла бы пойти по совершенно другому пути. Младший брат Карла, возможно, стал бы королём Арагона, и непрочный испанский союз мог распасться. Более того, испанские, или, скорее, кастильские ресурсы не были бы растрачены на серию имперских войн, которые совсем немного служили интересам страны, ибо тогда как Арагон смотрел в сторону Италии и Средиземного моря, интересы Кастилии были сосредоточены на богатых, всё расширяющихся, всё ещё частично неисследованных землях Америки. Но все эти предположения остаются чисто умозрительными, а реальностью была умирающая женщина в Тордесильясе, никогда из-за своей психической неполноценности не имевшая власти, которая по праву принадлежала ей.