Жребий был брошен. Когда Дон Карлос узнал, что Филипп вернулся из Эскориала в Мадрид, он занервничал, предполагая, что отцу стало что-то известно. Ему сказали, что королю действительно очень не нравится его поведение, хотя когда через несколько дней отец и сын на самом деле встретились лицом к лицу, они оба притворились. Дон Карлос имел ещё одну беседу со своим дядей доном Хуаном, в связи с которой сохранились две разные версии. Согласно одному отчёту, Дон Карлос ещё раз сказал о своём решении сесть в полночь на корабль в Картахене и попросил дона Хуана о помощи. И дон Хуан опять уклонился от ответа. Согласно другому отчёту, Дон Карлос спросил своего дядю, что произошло в Эскориале, и когда тот начал отвечать уклончиво, схватился за шпагу. Когда дон Хуан отошёл к двери, он обнаружил, что она заперта на засов, и ему пришлось вызвать служителей принца, чтобы её открыли.
Это произошло в 11 часов ночи 18 января 1568 г., когда Дон Карлос уже лёг спать. Филипп в сопровождении своих приближённых — герцога Фериа, приора Дона Антонио де Толедо, Луиса де Кихада и Руя Гомеса, принца Эболи, который был управляющим хозяйства принца, вошли в покои Дона Карлоса с двумя служителями, которые несли молотки и гвозди. Герцог Фериа возглавлял процессию с фонарём в руке; у короля под одеждой были доспехи. Несмотря на предосторожности Дона Карлоса, они без труда открыли дверь, так как механизм был обезврежен. Принца взяли за руки. Он спросил:
— Кто это?
— Государственный совет, — ответили ему.
Когда он увидел отца, он вскричал:
— Ваше величество хочет меня убить?
Король, как всегда сдержанный, обещал, что ему не причинят вреда.
— То, чего я хочу, — для твоего же блага.
Служители забили окна, унесли всё оружие, даже кочергу, а также бумаги принца. Дон Карлос упал на колени перед отцом:
— Ваше величество, убейте меня, но не арестовывайте — это будет огромным скандалом для вашего королевства. Если ваше величество меня не убьёт, я сам убью себя.
Он двинулся к камину как будто для того, чтобы броситься на горящие брёвна. Дон Антонио сцепился с ним, а король холодно произнёс:
— Если ты себя убьёшь, это будет поступок безумца.
— Я не безумен, — пробормотал принц, — я в отчаянии от того, что ваше величество так плохо со мной обращается.
Отчаянно рыдая, он продолжал упрекать своего отца за его жестокость.
— С этих пор я не буду относиться к тебе как отец, — единственное, что произнёс король.
Он приказал сопровождающим никогда не оставлять принца одного ни днём, ни ночью.
— Я надеюсь на верность и преданность, которую вы всегда проявляли ко мне.
Принц был заточён в башню замка Аревало, где его бабушка в пятом поколении, безумная бабка безумной Хуаны, Изабелла Португальская, провела свои уходящие годы, и его надсмотрщиком был сын жестокого тюремщика его прабабки Хуаны.
Известие о поступке Филиппа со звоном пронеслось по всем дворам Европы, вызвав ужас у его друзей и радость у его врагов. Мачеха Дона Карлоса и его тётка Хуана пытались за него заступиться. Французский посол докладывал, что Елизавета плакала два дня, не могла говорить о случившемся без боли и была так несчастна, как будто Карлос был её собственным сыном. Но в разговоре с послом она косвенно признала его ненормальность, когда сказала: «Богу было угодно, чтобы все узнали о его особенностях».
Как всегда скрытный, Филипп оставался молчаливым и неумолимым. «Король, — писал дон Хуан де Суньига, испанский посол в Риме, — он не представил никакой особой причины своего поступка для вашего святейшества, но я не думаю, что случилось что-нибудь помимо того, что мы всё знаем о поведении принца». Позже, в мае, Филипп дал наиболее полное из всех объяснение своему поступку. «Это не была, — докладывал он папе Пию V, — необузданность принца или его проступок, и не намерение с моей стороны наказать или исправить его, ибо если бы таковы были мои мотивы, я бы предпринял другие меры, не доходя до такой крайности… Но так как, за мои грехи, это была воля Божья, чтобы принц отличался такими крупными и многочисленными недостатками, частично умственными, частично обусловленными его физическим состоянием, и он совершенно не соответствует требованиям, необходимым для правления, я увидел, какой громадный риск возникнет, если он станет наследником, и какую очевидную опасность это повлечёт; и следовательно, после долгого и тщательного раздумья, и тщетно перепробовав все возможные варианты, я убедился, что надежды на то, что со временем его состояние улучшится, нет никакой или очень мало, и необходимо предотвратить те напасти, которые можно разумно предвидеть. Короче, решение моё было необходимым».