Биология. В 3-х томах. Т. 2

Если окисленная форма ДХФИФ при смешивании с тканевым экстрактом обесцвечивается, то можно предположить, что причина этого — присоединение атомов водорода от янтарной кислоты. Добавим к смеси янтарную кислоту. Если теперь скорость обесцвечивания возрастает, то это подкрепит нашу гипотезу о том, что ДХФИФ играет роль акцептора атомов водорода, отщепляющихся от янтарной кислоты.

Поскольку большинство реакций в живых организмах катализируется ферментами, ясно, что окисление будет происходить лишь в том случае, если в среде имеется надлежащий фермент. Реакцию окисления янтарной кислоты катализирует фермент сукцинатдегидрогеназа, и дополнительные исследования позволяют выявить присутствие этого фермента. В нашем опыте источником фермента будет служить суспензия митохондрий из прорастающих семян маша (Phaseolus aureus). Важно выделять митохондрии как можно быстрее. После разрушения клеток метаболизм почти сразу же прекращается.

Опыт делится на две части: 1) выделение нужного фермента и 2) использование его для окисления янтарной кислоты. ДХФИФ служит индикатором, который позволяет определить, идет ли реакция или нет.

Все, что требуется для первой части опыта (т.е. для приготовления ферментного экстракта), желательно до начала работы не менее часа выдержать в холодильнике.

Материалы и оборудование

4 центрифужные пробирки (по 15 мл)

2 стеклянные палочки

2 градуированные пипетки на 10 мл

2 лабораторных стакана емкостью 1 л (желательно полиэтиленовые)

Лед

Соль

Семена маша

Пробирки со штативом 1 градуированная пипетка на 1 мл

Таймер

Растворы (указания относительно приготовления растворов даны после описания опыта):

Забуференный раствор сахарозы

Забуференный раствор сахарозы + раствор янтарной кислоты

0,1%-ный ДХФИФ (приготовляется на забуференном растворе сахарозы) Дистиллированная вода

Методика

1. Прорастите семена маша (24 шт.), поместив их на влажную вату и оставив в темноте на 3-4 дня.

2. Приготовьте ледяную баню: положите лед в полиэтиленовый стакан емкостью 1 л и добавьте к нему соли, чтобы понизить температуру.

3. Поместите в стакан со льдом забуференный раствор сахарозы и две центрифужные пробирки.

4. Удалите у 12 проросших семян оболочки и корешки.

5. Поместите в каждую центрифужную пробирку по шесть семян.

6. Добавьте в каждую пробирку по 1 мл забуференного раствора сахарозы, не содержащего янтарной кислоты.

7. Тщательно размельчите семена с помощью охлажденной стеклянной палочки; пробирки должны при этом все время оставаться в стакане со льдом.

8. Добавьте в каждую центрифужную пробирку еще по 10 мл забуференного раствора сахарозы.

9. Поместите центрифужные пробирки в центрифугу (друг против друга) и прокрутите их при максимальной скорости в течение 3 мин.

10. Верните центрифужные пробирки в стакан со льдом.

11. Внесите пипеткой в одну из лабораторных пробирок 15 мл дистиллированной воды и отметьте положение мениска.

12. Вылейте дистиллированную воду и заполните пробирку до отметки надосадочной жидкостью из центрифужных пробирок.

13. Следующее необходимо проделать очень быстро: добавьте в ту же лабораторную пробирку 0,5 мл раствора ДХФИФ и перемешайте содержимое, заткнув пробирку большим пальцем и перевернув ее.

14. Во время перемешивания растворов включите отсчет времени.

15. Отметьте цвет раствора через 20 мин.

16. Повторите весь эксперимент, использовав на этот раз забуференный раствор сахарозы, содержащий янтарную кислоту.

Проследить за ходом эксперимента можно и с помощью колориметра.

1. Поставьте красный фильтр, включите колориметр и дайте ему прогреться в течение 5 мин.

2. Добавьте 0,5 мл раствора ДХФИФ к 15 мл надосадочной жидкости, как описано выше.

3. Смешайте растворы и включите отсчет времени.

4. Поместите пробирку в колориметр и установите прибор на 0% пропускания.

5. Снимите показания колориметра через 1, 2, 5, 10 и 20 мин.

6. Повторите тот же опыт, но с забуференным раствором сахарозы, содержащим янтарную кислоту.

7. Постройте график зависимости пропускания (ось ординат) от времени.

8. Сформулируйте выводы, которые можно сделать на основании полученных результатов.

Приготовление растворов

Забуференный раствор сахарозы (100 мл)

Гидрофосфат натрия (Na₂HPO₄) 0,76 г

Дигидрофосфат калия (КН₂РО₄) 0,18 г

Сахароза 13,60 г

Сульфат магния 0,10 г

Забуференный раствор сахарозы + янтарная кислота (100 мл)

Забуференный раствор сахарозы, приготовленный, как описано выше, плюс:

Янтарная кислота 1,36 г

Гидрокарбонат натрия 1,68 г