Альфонсо, однако, продолжил своё путешествие в Феррару. Ожидалось, что он спешится, согласно обычаю, во дворце Бельведер, и знать Феррары собралась там, чтобы встретить его. Но он разочаровал их ожидания, отправившись сначала инкогнито навестить герцогиню, свою мать, в её дворце в черте города. На следующий день он удалился в Бельведер, где оставался в уединении до завершения подготовки к его первому публичному въезду в Феррару в качестве герцога.
По прибытие своим первым актом милосердия он, наконец, освободил к восторгу народа своего престарелого родственника Джулио д'Эсте, сводного брата Альфонсо I, который за участие в заговоре 1505 года провёл пятьдесят три ужасных года в тюрьме.
26 ноября 1559 года Совет магистратов Феррары собрался во дворце Бельведер и его глава, граф Галеаццо Тассоне вручил герцогский скипетр Альфонсо II. После чего молодой герцог совершил великолепное «шествие по городу, который снова был по-королевски украшен триумфальными арками в разных местах». Так как Альфонсо был всеобщим любимцем, горожане разразились громкими приветствиями, а знаменитая артиллерия Феррары продолжала беспрерывный салют. Клятва верности в соборе и акт милосердия в честь Джулио завершили этот день. Более мрачная церемония была запланирована назавтра. Это было празднование похорон покойного герцога, которое проходило в Кафедральном соборе, хотя тело уже было предано земле в церкви Корпус Домини. В герцогской часовне был приготовлен катафалк, освещённый многочисленными свечами, и на него были установлены носилки со статуей, представляющей покойного. В сопровождении феррарской знати прибыли двадцатишестилетний герцог и его дядя Альфонсо д’Эсте, граф Монтеккьо, и заняли свои места под большим балдахином, где выслушали надгробную речь, составленную секретарём Джаном Баттистой Пиньей. Траурная процессия всего двора к церкви, где был похоронен Эрколе II, завершила церемонию.
Альфонсо II ознаменовал своё восшествие на престол различными милостями городу Феррара и другим городам, и объявил о начале своего правления итальянским дворам с помощью своих послов. 26 декабря был избран новый папа Пий IV и три вечера подряд в Ферраре устраивались грандиозные празднества в ознаменование этого события. Молодой герцог отправил в качестве чрезвычайного посла к новому понтифику графа Ипполито Турки, которому было поручено по прибытии связаться с епископом Англонским (обычным послом), кардиналом Ипполито д’Эсте и кардиналом Карлом де Гизом, и, с их помощью, добиться от Пия кардинальской шапки для младшего сына Рене, Луиджи д'Эсте.
С самого начала своего правления Альфонсо II представил доказательства того, что он унаследовал литературные вкусы, которые на протяжении поколений отличали семью Эсте. Он восстановил и вновь открыл Феррарский университет, который практически прекратил своё существование в последние годы жизни его отца. Он внёс щедрые дополнения в библиотеку Эстенсе, которую в старину обогатили завещания его предков. Помимо того, герцог приказал закупать за любые деньги все книги, которые были подарены миру с момента изобретения книгопечатания. Он также объявил о своём намерении открыть типографию в Ферраре.
17 февраля 1560 года Лукреция Медичи, наконец, торжественно въехала в Феррару. Но так как молодая герцогиня из-за слабого здоровья почти всё своё время проводила в своих личных покоях, управлять государством во время отсутствия сына приходилось Рене. Полагаясь на своё влияние на Альфонсо II, его мать не считала нужным скрывать свою склонность к новой религии.
– …с этого дня (смерти мужа) Рене полностью перешла из сферы Возрождения в сферу Реформации, – утверждает М. Бересфорд Райли.
Тем временем её старший сын отправился в Рим, чтобы в мае 1560 года совершить обычный унизительный акт поклонения, требуемого от вассала Святого Престола. Воспользовавшись этим, Пий IV сообщил ему о новом скандале, в который «ересь матери правящего герцога Феррарского» снова ввергла дом Эсте. Альфонсо II не осмелился возражать папе и по возвращении в Феррару, «после тщетных молитв с его стороны, а также увещеваний и доводов учёных и религиозных людей», по словам хрониста, он поставил свою мать перед выбором: либо сменить религию, либо уехать из Италии. В свой черёд, Анна д’Эсте передала ей приглашение вернуться во Францию от королевы-матери Екатерины Медичи, желавшей использовать принцессу-кальвинистку в борьбе за власть. На этом же настаивал Субиз в надежде, что возвращение Рене усилит позиции протестантов при дворе.
Тогда вдова решила посоветоваться с Кальвином. Не скрывая своего колебания, реформатор предупредил её:
– Правительство, в котором они Вас просят принять участие, сегодня настолько сбито с толку, что весь мир плачет.
Если же она настаивает на отъезде, ей придётся «измениться, чтобы служить Богу с разборчивостью, стремясь к цели, не запутываясь в сетях, которые было бы трудно разорвать».