(до июня 1939 г. заказ № 44) После вступления в строй вошла в состав Второго ДПЛ Первой эскадры Шестого флота и до апреля 1941 г. занималась боевой подготовкой во Внутреннем японском море. В мае 1941 г. в Куре на верфи флота смонтировали оборудование для транспортировки и боевого использования карликовой лодки тип А. В июле 1941 г. I-16 возглавила Специальную группу ПЛ капитана 1 ранга Ханку Сасаки и до октября 1941 г. на подходах к бухте Токуяма (на юго-востоке о. Хонсю) занималась боевой подготовкой. 18.11.1941 г. корабль пришел в Куре, где на арсенале флота принял на борт карликовую лодку тип А. 25.11.1941 г. I-16 направилась к Гавайским о-вам. 5.12.1941 г. она заняла позицию в 100 милях к западу от о. Оаху. 6.12.1941 г. в восьми милях от берега корабль направил свою карликовую лодку в гавань Перл-Харбор для атаки боевых кораблей противника. 7.12.1941 г. группа Сасаки не добилась каких-либо результатов. 9.12.1941 г. I-16 оставила район ожидания и направилась к атоллу Джонстон для его обстрела. Ввиду выхода из строя гирокомпаса лодка на цель не вышла, прекратила патрулирование и 29.12.1941 г. пришла на атолл Кваджелейн. 2.01.1942 г. она направилась к Гавайским о-вам для борьбы с кораблями противника. 9.01.1942 г. I-16 приступила к поискам американского соединения 14 во главе с АВ Saratoga, а 19.02.1942 г., по данным береговой авиации, пыталась обнаружить соединение противника в районе к юго-востоку от Маршалловых о-вов и 24.02.1942 г. возвратилась на атолл Кваджелейн. 27.02.1942 г. I-16 направилась в район к западу от Гавайских о-вов для борьбы с судоходством противника. 28.03.1942 г. ее включили в состав 1-го ДПЛ Восьмой эскадры Шестого флота и перебазировали на Пенанг. 12.04.1942 г. ПЛ возвратилась на атолл Кваджелейн и с 13-го по 27.04.1942 г. перешла в Пенанг с заходом на атолл Трук (18.04.1942 г.). 30.04.1942 г. корабль направился к восточному побережью Африки, имея на борту карликовую лодку типа А. 27.05.1942 г. I-16 пополнила запасы топлива со вспомогательного КР Хококу Мару. 31.05.1942 г. ПЛ подошла к о. Мадагаскар на дистанцию 10 миль и направила свою карликовую ПЛ в гавань Диего-Суарес, где она совместно с карликовой ПЛ с I-20 потопила английский ТН British Loyalty (6993 т) и тяжело повредила английский ЛК Ramillies. 2.06.1942 г. корабль оставил район ожидания и приступил к патрулированию на подходах к о. Мадагаскар. 3.06.1942 г. лодка (капитан 3 ранга К. Ямада) у западного побережья о. Мадагаскар артиллерийским огнем (выпустила 36 140-мм снарядов) потопила английское торговое судно (2400 т). 30.06.1942 г. I-16 в 600 милях к югу от о. Мадагаскар пополнила запасы со вспомогательного КР Аикоку Мару. 14-го и 15.07.1942 г. у южного побережья Индии корабль потопил два английских торговых судна (соответственно 3777 т и 4400 т). 10.08.1942 г. ПЛ возвратилась в Пенанг и с 22.10 по 5.11.1942 г. перешла на атолл Трук. 1.11.1942 г. ее включили в состав Специального соединения капитана 2 ранга Ота, предназначенного для атаки боевых кораблей противника у Лунга-Пойнт. 9.11.1942 г. I-16 вышла в море, имея на борту карликовую лодку типа А, которую 15.11.1942 г. в проливе Индиспенсейбл направили для атаки десантных судов противника. Из-за противодействия со стороны американских противолодочных сил, карликовая лодка была вынуждена выброситься на берег, не достигув цели. 16.11.1942 г. I-16 включили в состав Специального соединения контр-адмирала Хисао Мито, но 19.11.1942 г. она возвратилась на атолл Трук и 22.11.1942 г. вновь направилась к Соломоновым о-вам, имея на борту карликовую ПЛ типа А, которую 29.11.1942 г. выпустила у Лунга-Пойнт. Совместно с карликовой лодкой с I-20 (На-20) она тяжело поередила американский войсковой ТР Alchiba (6198 т). 10.12.1942 г. I-16 пришла в Рабаул и начала подготовку к транспортировке грузов. С 24-го по 26.12.1942 г. она перешла в Буин. Вероятно, в январе-феврале 1943 г., ПЛ доставляла в Каминпо грузы и в марте 1943 г. пришла в Метрополию, где в Куре на верфи флота провели текущий ремонт корпуса и механизмов. 13.05.1943 г. I-16 включили в состав Специального соединения контр-адмирала Кондо, призванного противостоять наступлению противника на Алеутских о-вах. Но данные об участии ПЛ в боевых действиях на севере Тихого океана отсутствуют. С 10-го по 30.07.1943 г. она перешла из Куре на атолл Трук. С 30.09 по 4.11.1943 г. I-16 патрулировала в районе к югу от Гавайских о-вов, а с 1.12.1943 г. по 15.03.1944 г. — у о-вов Джилберта. 1.01.1944 г. ее включили в состав 2-го ДПЛ Первой эскадры Шестого флота. 14.05.1944 г. ПЛ направилась в район к северу от Соломоновых о-вов для борьбы с судоходством противника. 19.05.1944 г. в 140 милях к северо-востоку от о. Шойзеул (Соломановы о-ва) корабль обнаружил и потопил глубинными бомбами американский эскортный миноносец Englaпd.