Беспокойство собравшегося в это время (1566 г.) английского парламента показало, что положение действительно опасно. Палаты видели только одно средство помочь делу: они снова обратились к королеве с просьбой вступить в брак и решить вопрос о престолонаследии. Как известно, эти меры больше создавали опасности, чем устраняли их. Определить престолонаследие — значило сразу обнажить меч; поэтому здесь королева твердо стояла на своем. После бешеного взрыва гнева она дала обещание выйти замуж, решившись, без сомнения, обойти его, как обходила раньше. Но ссора с общинами, вызванная запрещением с ее стороны обсуждать вопрос о наследовании (к этой ссоре мы вернемся позднее), сильно поразила Елизавету. «Тайные внутренние враги, — сказала она общинам, когда их ссора закончилась сердечным примирением, — думали причинить мне это зло, чего никогда не могли бы сделать враги внешние, а именно: навлечь на меня ненависть моих общин. Неужели вы думаете, что я не интересуюсь вашей безопасностью и престолонаследием, на что обращена вся моя забота, или что я намерена нарушить ваши вольности? Нет, никогда этого не было у меня в мыслях; я хотела только удержать вас от падения в пропасть». Однако она не могла указать настоящих мотивов своего поступка, и роспуск парламента вместе с возраставшей внешней опасностью поставил ее (1567 г.) лицом к лицу с недовольством народа.
Вдруг страшное событие рассеяло собравшиеся тучи. Мария воспользовалась Дарнли как орудием для гибели его сообщников и успеха своей политики, но после убийства Риццио она возненавидела и стала избегать его. С ее губ сорвались зловещие слова. Она сказала, что пока она не освободится от него каким-либо способом, ей и жизнь не мила. Жажда мести только усилилась в ней под влиянием страсти к графу Босуэлу, самому смелому и бессовестному из пограничных баронов. Отчаянный характер графа не отступал ни перед какими препятствиями, мешавшими его браку с королевой. Развод мог освободить его от жены. Дарнли мог стать жертвой заговора лордов, которых он покинул и предал и которые все еще считали его своим злейшим врагом. Изгнанные бароны были возвращены; пошли темные слухи. Ужасная тайна последовавшего затем события все еще окутана мраком сомнения и неизвестности, который, вероятно, никогда не будет совсем рассеян. Настроение королевы, по-видимому, вдруг изменилось. Ее ненависть к Дарнли сразу сменилась проявлениями старой привязанности. Пороки и бедствия довели его до болезни, Мария посетила больного и уговорила его последовать за ней в Эдинбург. Она снова навестила его в уединенном ветхом доме возле дворца, где его поместили по ее приказу, поцеловала его при прощании и весело поехала на свадебный пир в Холируд.
В два часа ночи ужасный взрыв потряс город, горожане бросились из ворот и нашли дом разрушенным, а труп Дарнли — под развалинами. Убийство, несомненно, было делом Босуэла. Скоро стало известно, что его слуга насыпал порох под спальню Дарили, а граф выжидал за городом окончания дела. Но, несмотря на сильное подозрение и на прямое обвинение в убийстве, предъявленное против него лордом Ленноксом, серьезной попытки расследовать преступление не было сделано; а слух, что Мария намерена вступить в брак с убийцей, привел ее друзей в отчаяние. Ее агент в Англии писал ей, что «если она выйдет за Босуэла, она утратит милость Божью, свою репутацию и расположение Англии, Ирландии и Шотландии». Но скоро все крепости королевства были отданы в руки Босуэла, и этот шаг послужил прелюдией к суду над ним и оправданию, которое подавляющая сила его сторонников превратила в простую комедию. Бессовестное требование развода устранило последнюю помеху для его честолюбия, королева была похищена на пути в Линлитгоу, и за этим последовал брак.
В один месяц все изменилось. Отвращение к браку с виновником смерти ее мужа вызвало восстание всего народа. Бароны, как католики, так и протестанты, собрались вооруженными в Стирлинге; их вступление в Эдинбург подняло восстание в столице. Мария Стюарт и Босуэл выступили с отличным войском навстречу лордам к Сетону, но их войско отказалось сражаться. Босуэл бежал и закончил жизнь в изгнании, а королева в бешеном отчаянии была привезена в Эдинбург и на проклятия толпы отвечала дикими угрозами. Из Эдинбурга в качестве пленницы ее отправили в крепость Локлевен. Она была вынуждена купить себе жизнь отречением от престола в пользу сына и передачей регентства своему брату, графу Меррею, который только что вернулся из Франции. В июле 1567 года ребенок по имени Яков VI был торжественно коронован.