Венский мир с венгерскими повстанцами и Турцией (1606) означал потерю всех прежних завоеваний и признание религиозной свободы в венгерской части монархии. Венское соглашение с венгерскими повстанцами гарантировало дворянам и горожанам Венгрии, а также пограничной страже, охранявшей рубежи габсбургских земель от турок, свободу вероисповедания. Были подтверждены основные привилегии венгерского дворянства, обещано расширение прав королевского совета и восстановление в Венгрии должности канцлера. Трансильванское княжество признавалось независимым. Таким образом, Венгрия получила особый статус в рамках империи Габсбургов — и, хотя этот статус в XVII столетии неоднократно нарушался, прецедент был создан. Отныне Венгрия, точнее, дворянство как ведущий в политическом отношении слой венгерского общества, имела юридически закрепленное признание собственной особости. Кроме того, к венгерским дворянам присоединились австрийские и даже моравские. Эта австро-венгеро-моравская сословная конфедерация, возглавляемая Маттиасом, представляла собой уступку основным принципам габсбургской политики: использовать абсолютную власть монарха для борьбы против антикатолической оппозиции. Маттиас стал венгерским королем и, за исключением центральной части монархии, т. е. Чешского королевства, поднял всю империю против Рудольфа. Маттиас двигался с войсками на Прагу. Но тут (1608) происходит нечто почти невероятное. Чешские, силезские и лужицкие подданные встали на сторону Рудольфа. Похоже, что чешские сословия приняли за оскорбление, что с ними никто предварительно не посоветовался: они считали себя важнейшим политическим звеном в габсбургской монархии.
Сыграл здесь свою роль и тот факт, что к конфедерации присоединились также моравские сословия. Поэтому и не нашла отклика пламенная речь моравского гетмана Карела из Жеротина, приехавшего на заседание чешского сейма с целью призвать чешские сословия присоединиться к оппозиции против Рудольфа. Когда же Маттиас подошел с войсками к Праге, чехи сумели с оружием в руках постоять за своего короля…
Последовавший за этим Либеньский мир стал, однако, для Рудольфа катастрофой. От его империи ему остались только земли королевства Чешского без Моравии и императорский титул. Остальная часть габсбургской монархии перешла во власть Маттиаса как венгерского короля и признанного наследника императорского престола. Помимо того, Рудольф вынужден был подписать в 1609 году указ о свободе вероисповедания в Чешском королевстве, ставший вознаграждением чешским протестантам за их верность Рудольфу в его борьбе с Маттиасом. Этот указ вошел в историю под названием «Грамота Его Величества Рудольфа».
Начиная с этой минуты, Рудольф думает только о мщении: он любой ценой хочет отомстить братупредателю и «неблагодарным» чешским протестантам, принудившим его издать грамоту. Он ищет и находит поддержку у своего двоюродного брата Леопольда, епископа Пассау. Этот безответственный и авантюрный служитель церкви, мечтающий стать наследником императора, набирает войско в десять тысяч человек самых различных национальностей под предлогом военной операции на территории монархии, где тогда разгорелся спор о наследстве после смерти Юлишско-Клевского герцога. Однако на самом деле войско вторгается в начале 1611 года в Чехию и с грабежами и насилием движется к Праге, несмотря на протесты чешского сейма.
Пражане вначале не могли и предположить, что Леопольда с его разбойничающими наемниками пригласил в страну сам Рудольф. Пассаусцам удалось занять только район Мала Страна, где начались многочисленные грабежи и убийства. Но вскоре им пришлось в спешке бежать, так как к Праге приближается со своим войском Маттиас. Происходит то, чего и можно было ожидать: Рудольф лишается чешской короны, и земский сейм провозглашает Маттиаса чешским королем. После торжественной коронации в соборе Святого Вита новый чешский король устраивает богатый прием, тогда как в южном крыле этого же дворца бродит мучимый завистью, низложенный Рудольф. Его владения ограничиваются теперь только Пражским Градом (Маттиас живет в Вене) и никому не нужным императорским титулом. Но мысли о мести не покидают Рудольфа… Правда, недолго. Не прошло и года, как в начале 1612 года, в возрасте неполных шестидесяти лет, он умирает от инфекционного легочного заболевания. Эпоха Рудольфа II заканчивается.
Современники утверждали, что Рудольф II был человеком мягким, но в то же время замкнутым, избегал встреч с людьми. Говоря о его характере, обычно употребляют слово «меланхолия», которое тогда входило в моду в связи с возобновившимся интересом к Гиппократу. Рудольф с преувеличенной гордостью воспринимал свою миссию властелина по милости Божьей, что было очевидным последствием его воспитания в Испании. Часто он преувеличивал и свои способности в качестве монарха, мнил себя великим военачальником, хотя никогда не был даже в военном лагере, не говоря уже о военных сражениях.