Рудольф хорошо разбирался в изобразительном искусстве, и его коллекции отличались не только большим количеством экспонатов, но и качеством. Королевский дворец украшали 3000 картин и 2500 скульптур, стоимость которых исчислялась головокружительной суммой в 17 миллионов гульденов. Страсть императора не ограничивалась только изобразительным искусством: он собирал часы, драгоценные камни, научные приборы и весьма сомнительные реликвии, например, гвозди из Ноева ковчега или флакончики с прахом, из которого Бог якобы сотворил Адама. Коллекция Рудольфа была «любимым ребенком» императора, для нее он находил все самое редкостное и удивительное.
Основу всемирно известной «кунсткамеры» Рудольфа составили две замечательные коллекции Максимилиана II, перенесенные в Градчаны из Вены и объединенные в одну, и коллекция итальянского покровителя искусств Жакобо ди Страда из Мантуи. Этот ученый антиквар и нумизмат, автор нескольких трактатов по монетам и медалям, был первым, кто попытался применить знания об этих вещах для обоснования исторических открытий и много сделал для возникновения археологии. Находясь в Италии, он свел короткое знакомство со множеством выдающихся художников и изучил их произведения. Сам Тициан написал его портрет.
При Максимилиане II он стал куратором Венских галерей и через год после восшествия Рудольфа на престол был приглашен в Прагу и назначен хранителем императорских коллекций. Страда и его сын Октавиус вскоре начали оказывать огромное влияние на двор императора, а Рудольф был столь уверен в их верности и лояльности, что даровал Жакобо титул рыцаря «фон Россберга». Их дружба укреплялась также горячей любовью Рудольфа к дочери Страда, которая, по свидетельствам историков, была удивительно красива и родила императору трех сыновей и трех дочерей.
Агенты, разосланные во все страны мира, искали для императорского музея всевозможные диковинки, древности, редкие произведения искусства… Источниками экспонатов стали не только Германия и Италия, но и Греция, Левант, Египет и даже Америка внесли свою лепту. Из Нового Света были доставлены, к примеру, многочисленные образцы индейского быта и искусства. Страсть Рудольфа к искусствам, по-видимому, частично передалась ему от его царственных предшественников. Величественный собор Карла IV, великолепный Бельведер Фердинанда, замок Карлштайн — все они тоже были заполнены шедеврами итальянских и немецких мастеров, собранными прежними правителями, и не могли не способствовать развитию аналогичной страсти у того, кто все это видел. Император, несомненно, находился под влиянием успехов великого герцога Фердинанда Тирольского, который пятнадцать лет правил Богемией и создал потрясающую воображение коллекцию замка Амбрас, чье богатство можно, если напрячь воображение, вообразить, глядя на экспонаты, все еще хранящиеся в королевском музее в Вене. Кунсткамера и галереи искусств быстро пополнялись, и вскоре в огромных Испанском и Германском залах им стало тесно, и они до отказа заполнили одно из крыльев замка. Коллекции также пополнялись дорогими подарками от благородных богемских граждан, иностранных посланников и городских богачей, которые жаждали заручиться благосклонностью императора для осуществления своих личных или политических стремлений. Так, один из министров преподнес Рудольфу в дар алтарь из слоновой кости, украшенный искусной резьбой; граф Фуггер прислал императору мраморный саркофаг, обнаруженный под Афинами, на котором были изображены сцены битвы с амазонками; граф Кевенхиллер, испанский гранд, подарил для галереи несколько картин Тициана, Петро Розы и Пармижианино, а бургомистр Нюрнберга — картину Хольбейна «Исаак благословляет Иакова» и «Троицу» Дюрера.
Возможно, самым известным из сокровищ была статуя Илионея, сына Ниобы, приобретенная Иоганном фон Аахеном у еврейского купца в Риме за тридцать четыре тысячи дукатов. Ее приписывают Скопасу, во времена Рудольфа она была в отличном состоянии, но из-за небрежного отношения к ней потомков от статуи остался лишь торс, который в 1782 году извлекли из темных подвалов замка, где он хранился все это время, и продали на аукционе за пятьдесят один крейцер — это примерно тринадцать центов в пересчете на современные деньги.