Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

_{Условия: прибор для КЭ — Beckman Р/АСЕ 2000; капилляр — 50 мкм, 54/51 см; поле 400 В/см; буфер: борат, pH 8.5; ввод пробы — давлением, 1 с.; детектирование — 214 нм: А — фенилтриметиламмонийхлорид, В — фталевая кислота, С — п-гидроксибензойная кислота, D — бензиновый спирт.}

5.4. Адсорбция на стенках

Молекулы пробы могут адсорбироваться на стенках за счет взаимодействия с отрицательно заряжеными силанольными группами кварца. При нейтральных и щелочных условиях разделения многие силанольные группы депротонируются и способствуют адсорбции положительных ионов пробы на стенке. В результате этого %-потенциал, образовавшийся на поверхности кварца, изменяется и, как следствие, изменяется подвижность электроосмотического потока, из-за чего происходит изменение времени выхода всех пиков. Кроме этого, из-за сильной адсорбции молекул пробы на стенках капилляра уменьшается интенсивность пика и это приводит в экстремальном случае к асимметричным пикам с большими "хвостами". Обработка таких пиков трудна, а часто невозможна.

Рис. 16. Влияние разницы в подвижности между ионом пробы и ионом буфера на форму пика.

_{Условия разделения: L=50/57 см; внутренний диаметр — 75 мкм; буфер — 5 мМ динитробензойная кислота, 0.5 мМ ЦТАБ (цетилтриметиламмонийбромид) pH 9.0;Е=-431 В/см; детектирование — непрямое, УФ 214 нм; проба — карбоновые кислоты по 25 ррм каждой.}

Из-за локальных воздействий на поверхностный потенциал кварца следует ожидать дополнительного изменения профиля потока, который отклоняется от идеальной "поршнеобразной" формы, что также способствует уширению полос. Особенно отчетливо можно наблюдать это явление в пробах, содержащих многозарядные положительные ионы. Вследствие повышения концентрации буфера ионообменное взаимодействие между пробой и силанольными группами подавляется, благодаря чему анализ становится возможным.

Особенно важным становится подавление адсорбции на стенках при разделении белков с помощью КЭ. В этом случае можно показать, что уже повышение емкостного отношения (как меры адсорбции на стенках) с 0.001 до 0,1 приводит к росту высоты эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ) с 0.5 мкм до 15 мкм.

При повторных вводах растворов, содержащих белок, часто наблюдается изменение времени выхода. Для раствора проблема решается в основном двумя различными способами. Согласно первому можно связать ковалентно с поверхностью капилляра гидрофильный слой, второй состоит в возможности добавления к разделительному буферу веществ, которые препятствовали бы ионному обмену.

В представленном на рис. 17 примере разделения белков ионообменное взаимодействие между стенками капилляра и молекулами белка подавляется введением в буфер добавок ДАП (1,3-диаминопропана). Из-за экранирующего действия ДАП пик лизоцима при повышении концентрации ДАП всегда симметричен, и при этом даже возрастает высота пика.

С улучшением симметрии пиков, обусловленным малой адсорбцией на стенках, сильно уменьшается разбавление веществ и пик становится выше. Поэтому снижения границы обнаружения можно добиться не только улучшая детектирование, но также в значительной мере за счет сокращения уширения полос. Этот пример ясно показывает, что только для пиков с высокой интенсивностью (малым разбавлением) достигается низкий порог обнаружения.

Из-за высокой концентрации добавок электропроводность буфера становится такой большой, что для разделения белков можно применять поле только небольшой напряженности, что ведет к удлинению времени анализа.

Устранение адсорбции на стенках будет более подробно описано в разделе, посвященном разделению белков.

5.5. Перегрузка системы разделения

Явление перегрузки наблюдается тогда, когда в систему разделения вводится слишком большое количество пробы. Так как в КЭ нет стационарной фазы, а разделительный объем ограничивается несколькими мкл, легко наступает явление перегрузки. Прежде всего, к перегрузке может привести неправильная регулировка прибора или слишком большая концентрация пробы. В качестве рабочего правила можно принять, что пробой может быть заполнено максимум 1–2 % от объема капилляра. Для капилляра длиной 50 см это соответствует максимальной длине зоны пробы 10 мм.

Рис. 17.Уширение полос из-за, адсорбции на стенках…