Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Низкие скорости потока (100 нл/мин) делают возможным сочетание КЭ с масс-спектрометрией (МС). Главная проблема при таком сочетании состоит, однако, в том, что в переходнике из капилляра в источник ионов элюент не будет всасываться из капилляра за счет существующего там вакуума. При падении давления 1 бар в капилляре длимой 1 м (внутренний диаметр 50 мкм) линейная скорость потока составляет 1 см/с. Возникающий в результате этого ламинарный параболический профиль потока привел бы к заметной потере эффективности. По этой причине перед ионизацией нужно проводить "улучшение" потока в капилляре. Ионизация электрораспылением позволяет осуществлять МС-детектирование биополимеров в результате образования множества заряженных частиц. В качестве примера показано разделение четырех фосфониевых ионов. Если записать общий ионный ток, то получим только два пика. Селективное детектирование отдельных соединений возможно при определенном соотношении масса/заряд (правая часть рис. 30).

Рис. 30. МС-детектирование при КЭ:

_{а) универсальное детектирование при регистрации полного ионного тока; б) Активное детектирование при регистрации отдельных соотношений массы к заряду.}

Рассматривались также другие методы детектирования (спектроскопия комбинационного рассеяния, измерение радиоактивности в режиме реального времени, круговой дихроизм, коэффициенты преломления света, капиллярная вибрация). Их возможности для рутинного использования в настоящее время еще не определены.

Само собой разумеется, что могут использоваться УФ-неактивные и нефлуоресцирующие пробы, если применять реагенты, употребляемые обычно для получения соответствующих производных перед разделением хромофоров и флуорофоров. В результате этого, однако проявляют себя недостатки предколоночного происхождения, известные из ВЭЖХ. Специальные реагенты для электрофореза, имеющие помимо хромофора еще и соответствующий заряд, являются темой для обсуждения.

При детектировании на основе лазерной флуоресценции для определения с помощью возбуждения на длине волны около 380 нм в большинстве случаев пробу перед разделением необходимо подвергнуть воздействию флуоресцентной метки. В качестве примера назовем разделение 3-(4-карбоксибензоил)-2-хинолин-карбоксиальдегид (КБХКА) — производных аминокислот.

Описаны первые экспериментальные разработки для получения производных после прохождения колонки, однако они пока еще не пригодны для использования вне стен исследовательских лабораторий.

В таблице 12 представлены достижимые границы обнаружения наиболее часто встречающихся систем детектирования. Из таблицы видно, что благодаря небольшому объему может достигаться высокая чувствительность по массе. Концентрационная чувствительность находится в пределах ВЭЖХ.

6.6. Количественный анализ

На воспроизводимость получаемых результатов влияет множество факторов: разница в электропроводности между разделительным электролитом и раствором пробы, большое различие в концентрации компонентов пробы и их электрофоретическая подвижность, различие в составе пробы. С другой стороны, преимущества КЭ проявляются тогда, когда необходимо проанализировать очень малые объемы проб; например, при 5 анализе ионов в дождевых каплях или в биологических пробах.

Рис. 31.Некоторые часто используемые реакции получения производных.

Миниатюризация ввода пробы в коммерческих приборах, между тем, прогрессирует так сильно, что из общего объема пробы 3 мкл в автоматизированных приборах можно сделать множество вводов. При этом, однако, не исключено, что состав пробы во время ввода изменится. Причина заключается в занесении буфера в пробу или в селективном вводе определенных компонентов пробы при электрокинетическом вводе. Работа со столь малыми объемами затруднена, если объем пробы в автозагрузчике может изменяться за счет испарения. Эти эффекты можно уменьшить при помощи охлаждения пробы или использования герметичного затвора в сосуде для пробы. Если необработанные данные анализа представлены в форме хроматограмм или фореграмм, то количественные результаты анализа получают или определением высоты пиков, или после интегрирования в виде площади пиков. Только в области определения примесей количественное выражение их концентрации через высоту более надежно, чем через площадь пика. Этому есть две причины: первая заключается в том, что при анализе примесей высота пика пропорциональна их концентрации, так как эффекты насыщения и перегрузки можно исключить, а вторая заключается в том, что ошибка автоматизированного определения высоты в этом случае меньше, чем при интегрировании пиков. Как только высота пиков возрастает, интегрирование становится рациональным и необходимым.