Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Термостатирование служит главным образом отведению джоулева тепла. Воздушные и жидкостные термостаты находят применение в коммерческих приборах, где температура может изменяться от 15 °C до 60 °C. Помимо охлаждения капилляра за счет окружающего воздуха, имеются также хорошо разработанные методы отвода джоулева тепла от капилляра. В большинстве случаев отвод тепла достигается за счет сильного воздушного охлаждения, при котором капилляр обдувается воздухом со скоростью до 20 см/с. Еще эффективней отвод тепла с помощью охлаждающей жидкости (тепловое сопротивление 2.5∙10^-4 В/см*К) вместо воздуха. Она будет омывать кроме этого "вход" около детектора и "выход" около капилляра. При этом с водой можно работать до разделительного напряжения 15 кВ, для более высокого напряжения применяют дорогостоящие фторуглеводороды. Влияние температуры на эффективность и селективность разделения в настоящее время еще обсуждается. По этой причине в случае коммерческих приборов термостатируются только капилляры (или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. Для разделения фрагментов ДНК в заполненных гелем капиллярах было показано, что хотя с повышением температуры производительность разделения снижается, относительная миграция, т. е. селективность разделения, может улучшиться. Дополнительно к термостатированию капилляра в некоторых приборах имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы. Это особенно полезно при анализе термолабильных проб. Недостатком этих конструкций является то, что помимо пробы охлаждается также разделительный буфер и поэтому существует разность между температурой разделительного буфера и выбранной температурой разделительного капилляра.

6.5. Детектирование

При детектировании в КЭ компоненты пробы проходят через часть капилляра, в которой происходит детектирование в режиме реального времени или детектируются на конце капилляра в режиме с разделением времени. При этом, в отличие от хроматографии, необходимо обратить внимание на то, что через детектор пробы движутся с различными скоростями.

6.5.1. Уф-детектирование

Большинство аппаратурных требований не в последнюю очередь относятся к детектированию, так как при детектировании непосредственно в колонке УФ-поглощение происходит в слое очень малой толщины. Несмотря на это, наиболее часто применяемыми детекторами для измерения УФ-поглощения являются детекторы, применяемые в ВЭЖХ. Из-за очень малой толщины слоя (средняя величина внутреннего диаметра капилляра) к детекторам предъявляются высокие требования, касающиеся чувствительности, шумов, влияния светорассеяния и т. д. Для того, чтобы избежать потери эффективности из-за смешивания вне капилляра, детектирование осуществляют прямо в капилляре.

Типичная ширина зоны в капилляре находится в пределах 5 мм (N = 500000), что соответствует объему 10 нл (капилляр диаметром 50 мкм). Этот крайне малый объем является также причиной очень высокой чувствительности по массе, часто встречающейся в рекламе. Мировым рекордом является в настоящее время порог обнаружения в 300 молекул при отношении сигнал/шум три к одному для аминокислот и индуцируемой лазером флуоресценции. Для рутинного применения, однако, более важна концентрационная чувствительность. Она более чем скромна из-за короткого пути поглощения (средний диаметр капилляра).

При УФ-детектировании в КЭ концентрационная чувствительность в 30-100 раз ниже, чем в ВЭЖХ. Это зависит для поперечно облучаемых капилляров от шумов детектора и эффективной толщины слоя, которая отличается от номинальной (равной диаметру капилляра) в сторону уменьшения. Заметно мешает также частичное светорассеяние из-за несовершенной фокусировки (свет стенок капилляра) и неидеальной цилиндрической формы капилляра. Оптимизацией оптики (щель, линза и т. д.) можно в основном исключить эти эффекты. Очень трудной оптимизацию оптики УФ-детекторов для КЭ делает также полное внутреннее отражение. На рис 25 показаны рассчитанные световые пути для различных апертур диафрагмы и капилляров.