Интернет-журнал "Домашняя лаборатория", 2008 №3

Еще эффективнее может концентрироваться проба, если поле после гидродинамического ввода прикладывается на короткое время в противоположном направлении. При условии, что ионы, которые нужно определять, перемещаются в направлении против ЭОП, капилляр может заполняться раствором пробы почти до детектора (гидродинамический ввод), и раствор пробы может удаляться из капилляра исключительно за счет инверсии полярности. Одновременно ионы, перемещающиеся против ЭОП, могут концентрироваться в пограничном слое между раствором пробы и разделительным буфером. Прежде, чем этот пограничный слой достигнет входа в капилляр, с помощью переполюсовки источника напряжения может начинаться собственно разделение. Точный момент времени для переполюсовки можно установить, следя за изменением тока, так как ток в процессе концентрирования постоянно увеличивается. Причина этого в том, что зона раствора пробы (с высоким сопротивлением) удаляется из капилляра, Когда сила тока достигает примерно 90 % от максимального значения (капилляр заполнен только разделительным буфером), то источник напряжения может переполюсовываться и молекулы пробы, удерживаемые в узкой зоне вблизи входа капилляра, разделяются. На рис. 24 показаны отдельные стадии этого способа ввода, который в целом называется "стэкинг" с обращением поля. Из-за большого вводимого объема ионы пробы концентрируются примерно тысячекратно. Недостатком метода является то, что при слишком поздней переполюсовке часть ионов пробы выходит из капилляра, и что могут анализироваться только либо анионы, либо катионы.

Рис. 24.Обогащение пробы с помощью изменения направления поля.

Другая возможность использовать негомогенность буфера для концентрирования молекул пробы состоит в выборе буфера и (или) растворов пробы с различными значениями pH. При этом подвижность ионов при прохождении скачка pH на приграничной поверхности между буфером и раствором пробы изменяется и происходит концентрирование. Например, белки вводятся из раствора при высоком значении pH и разделяются в буфере с низким значением pH, поэтому молекулы пробы перемещаются в щелочной среде из-за их отрицательного заряда сначала в направление анода, протонируются в приграничном слое буфера и прекращают свое перемещение (отсутствие эффективного заряда). Благодаря диффузии и миграции протонов и гидроксид-ионов ступенька pH исчезает, что приводит к разделению пробы с помощью КЗЭ. Аналогично концентрируются пробы с помощью ИЭФ. ИТФ может также использоваться как "стэкинг" в режиме реального времени. Сам принцип разделения будет описан позже Для проведения "стэкинг"-процесса необходимо использовать ведущий и конечный электролиты, чьи подвижности несколько больше (ведущий электролит) или несколько меньше (конечный) чем подвижности ионов пробы. При этом в большинстве случаев в качестве разделительного буфера будет применяться ведущий электролит и после ввода пробы часть капилляра будет заполнена конечным электролитом. Вначале, после включения напряжения, компоненты пробы подвижность которых находится между подвижностью ведущего и конечного электролитов, за счет ИТФ концентрируются в узкие полосы через некоторое время зона конечного электролита из-за диффузии и миграции ионов расплывается и это приводит к зонноэлектрофоретическому разделению ионов. При этом методе порог обнаружения снижается примерно в 500 раз. В этой форме можно проводить ИТФ-обогащение компонентов пробы с помощью коммерческой аппаратуры. Более эффективного обогащения можно достичь применяя два разделительных капилляра. Сначала ИТФ проводится в относительно толстом капилляре, снабженном на конце детектором по электропроводности. С помощью измеренного там сигнала можно точно определить, когда сконцентрированная проба может переводиться в разделительный капилляр, установленный также на конце этого капилляра. При этом достигалось примерно 10000-кратное обогащение. Другой метод совмещает хроматографическое обогащение с последующим КЗЭ. Для этого предлагаются специальные капилляры, которые со стороны «входа» имеют зону несколько миллиметров заполненную хроматографической фазой (в основном С18).

Обогащение осуществляется при прокачивании раствора пробы через капилляр, при этом гидрофильные молекулы пробы адсорбируются в режиме обращенной фазы и могут быть десорбированы после ввода пробы с помощью метанола или ацетонитрила. При этом растворитель может переноситься к стационарной фазе как с помощью давления, так и с помощью ЭОП При этом, однако, важно, чтобы пространство между стационарной фазой и детектором заполнялось разделительным буфером. Преимуществом этого метода является его пригодность для неионной гидрофобной пробы. Эта техника, однако, из-за плохой воспроизводимости, а также из-за высокой стоимости разделительного капилляра мало распространена. Обзор методов снижения порога обнаружения при КЭ за счет концентрирования пробы в режиме реального времени дан в таблице 11.

6.4. Термостатирование