Эти припадки ревности причиняли много страданий Изабелле; после одного из них Филипп объявил, что больше никогда не будет иметь отношений со своей женой. Дело в том, что в то время непостоянный Филипп влюбился в одну из фрейлин Хуаны и, как обычно, не скрывал своего увлечения. Это была молодая женщина с прекрасными золотыми волосами, и Филипп ее обожал. Хуана в приступе ревности связала женщину по рукам и ногам и остригла ей волосы.
Когда Филипп увидел, что произошло, он объявил о своем намерении порвать с женой.
Можно вообразить, как подействовал такой скандал на набожную Изабеллу. Однако у Филиппа и Хуаны уже было два сына, родившиеся до того, как у нее стали проявляться признаки психического расстройства. Одного из них звали Карл, он родился 24 февраля 1500 г. и впоследствии достиг большой славы, став императором Австрийским Карлом V и Карлом I Испанским. Другого звали Фердинанд. Он родился 10 марта 1503 г.
Последние месяцы жизни Изабеллы были полны тревог. Она размышляла о том, что будет, когда ее не станет. Думала о честолюбивых муже и зяте, о внуках — один из них был еще в колыбели, другой уже вышел из этого возраста, а также о бедной сумасшедшей дочери Хуане, наследнице кастильского трона.
К тому же Фердинанд заболел лихорадкой, что ичень обеспокоило Изабеллу. Это беспокойство, в сочетании с переживаниями, вызванными состоянием Хуаны, сильно подорвало здоровье Изабеллы. Она была очень подавлена из-за болезни Фердинанда и отказалась верить докторам, когда они уверяли ее, что его болезнь отнюдь не смертельна и Фердинанд выздоровеет. Фердинанд выздоровел, но сама Изабелла подхватила лихорадку и не смогла оправиться.
Ее состояние становилось все хуже, всему двору и самой Изабелле стало ясно, что она близка к кончине.
Она всегда очень серьезно относилась к своим обязанностям и в таком болезненном состоянии продолжала вести дела, например, принимала посланцев даже тогда, когда уже не могла подняться с постели.
В октябре 1504 г. она стала тщательно готовить завещание. В нем высказала пожелание, чтобы ее тело захоронили во францисканском монастыре Св. Изабеллы в Альгамбре и чтобы ее похороны были как можно проще, а похороны Фердинанда богатыми. При этом основная часть могилы предназначалась для Фердинанда, а свое тело она велела захоронить на скромном остатке земли. Это символизировало то, что они при жизни были вместе и что смерть не смогла их разлучить. Она пожертвовала денежную сумму для благотворительных целей и отдала долги. Настаивала на том, чтобы преемники поддерживали целостность государства и контролировали Гибралтар. Кастильская корона передавалась ее дочери Хуане и, как супругу королевы, мужу Хуаны, эрцгерцогу Филиппу.
Затем она подумала о том, кто должен будет править государством. Она назначила своего мужа Фердинанда регентом до тех пор, пока ее внук Карл не сможет править.
Были и другие указания, при этом основными душеприказчиками назначались Фердинанд и Хименес.
26 ноября 1504 г., всего через три дня после составления завещания, она умерла.
Фердинанд отказался от кастильской короны, и на большой площади в Толедо было объявлено о новых правителях. Хуана и Филипп были в то время во Фландрии и, в соответствии с завещанием, Фердинанд принял регентство.
Однако кастильцам было неприятно видеть арагонца своим правителем, даже в должности регента. Они мирились с правлением Фердинанда при жизни Изабеллы, поскольку воспринимали его как мужа своей королевы; другое дело было, когда он стал править без нее. Некоторые гранды, например Хуан Пачеко, маркиз Вилленский и герцог Нахарский, письменно связались с эрцгерцогом Филиппом и стали убеждать его принять верховную власть в Кастилии, так как хотели, чтобы Фердинанд вернулся в Арагон.
Фердинанд с неуважением отозвался о Филиппе и спросил, как же тот сможет править испанцами, если он их так мало знает. Но все же Фердинанд посоветовал ему приехать вместе с Хуаной и показаться народу.
Между тем у Фердинанда становилось все больше врагов. Филипп, однако, был великодушен и согласился с Фердинандом.
Хуана, которая стала хуже относиться к своему мужу, написала письмо, в котором высказала пожелание, чтобы ее отец продолжал править Кастилией. Секретарь, которому Хуана доверила это письмо, был пойман и заточен в подземелье. Филипп, рассерженный на жену, заключил ее под стражу и содержал в условиях, усугубивших ее сумасшествие.