С конца XV в. в русско-литовских отношениях обозначились важные перемены. Начиная с Ивана III московские правители провозгласили своей главной внешнеполитической целью объединение всех восточнославянских земель под эгидой московских правителей — потомков Владимира Киевского и его законных наследников. В проведении этой политики московские правители опирались на поддержку всего русского общества, воспринимавшего образовавшееся Русское государство как исторического преемника, продолжение Древнерусского государства. Достижение такой цели означало бы конец существования Великого княжества Литовского как великой державы. Осуществление этой программы должно было затронуть и интересы Польского королевства, завладевшего землями современной Западной Украины.
Русские правители обнаружили большое упорство в борьбе за достижение своей цели. Одной из характерных черт руссколитовских отношений в XVI в. стало заключение с Литвой лишь краткосрочных перемирий — заключение мира означало бы признание прав потомков великого князя литовского Ягайлы — Ягеллонов на власть над восточнославянскими землями, на что правящие круги в Москве не желали пойти.
Серию русско-литовских войн открыла в конце 80-х гг. XVI в. «пограничная война», когда обе стороны поддерживали своих сторонников на территории Верховских княжеств. С 1492 г. военные действия со стороны России перешли в открытую войну, которая завершилась вхождением в состав Русского государства не только Верховских княжеств, но и значительной части Смоленской земли (Вязьма и ряд других городов). Еще более неудачной для Литвы оказалась новая война, начавшаяся в 1500 г. В июле этого года армия Великого княжества Литовского была разбита в сражении на реке Ведроше, в плен попал сам главнокомандующий князь Константин Острожский. По миру, заключенному в 1503 г., в состав Русского государства вошла Северская земля с ее основными центрами — Новгородом-Северским и Черниговом. Успех военных кампаний был связан не только с удачными военными действиями русских войск. Не меньшее значение имел переход на русскую сторону большей части сидевших на этих землях князей вместе с их населением. Достигнутые успехи были столь значительными, что на мирных переговорах 1503 г. Иван III выступил с притязаниями на Киев — историческую столицу Древнерусского государства.
В дальнейшем, однако, на пути к осуществлению московских планов возникли серьезные трудности. Восточные области Великого княжества Литовского, население которых в конце XV — начале XVI в. перешло на сторону Москвы, были сравнительно слабо связаны с этим государством, в них во многом сохранялись традиционные для древнерусского общества институты. Иное положение сложилось на основных территориях Великого княжества Литовского. Правда, к началу XVI в. восточных славян объединял общий язык, сознание единства происхождения, общие культурно-исторические традиции, у них сохранялось представление о принадлежности к одному «русскому» народу, лишь временно разделенному политическими границами. Однако к тому же времени в результате длительного самостоятельного развития в Русском государстве и на восточнославянских землях Великого княжества Литовского сложилось два существенно отличавшихся друг от друга общества. Конец XIV–XV в. стали временем больших перемен в жизни населения Великого княжества Литовского. Именно в это время на его территории быстрыми темпами стало формироваться крупное феодальное землевладение. В руки феодалов-землевладельцев перешла большая часть ранее очень значительного фонда государственных земель не только на белорусских и украинских землях, но и на территории этнической Литвы. К началу XVI в. образовались большие магнатские латифундии, находившиеся в руках литовской католической знати и сидевших на Волыни православных потомков Гедимина. По данным «пописа» войска Великого княжества Литовского 1529 г., вооруженные отряды литовских магнатов и князей Волыни составляли большую часть войска этого государства. Меньшая часть фонда государственных земель перешла в руки местного литовского и «русского» боярства в отдельных землях Великого княжества. Образовавшийся слой мелких и средних землевладельцев получил название «шляхта», как обозначались представители дворянского сословия в соседней Польше.