Лавра, расположенная в холмистой овражистой местности на берегах речки Кончуры, окружена довольно массивной каменной стеной, имеющей вид неправильного четырехугольника, длиной немного более версты. Высота стены, вместе с зубцами, простирается до четырех сажен, а толщина ее три сажени. В стене устроены каморы и бойницы или амбразуры для выстрелов в два, местами в три яруса. По углам и по бокам возвышалось до двенадцати башен, одни глухие, другие с воротами (Конюшенная, Красная, Водяная и пр.). С юга и запада к стенам примыкали пруды, которые затрудняли подступы с этой стороны. Монастырские слободы и предместья при появлении неприятеля, по обычаю, были выжжены; вне стены сохранили только дворы пивной и конюшенный, укрепленные тыном и опиравшиеся на речку Кончуру. Благодаря своим обширным земельным имуществам и многим селам, монастырь имел возможность заблаговременно приготовить большие склады хлеба и всяких запасов. Но расходовать их приходилось с великой бережливостью вследствие скопившегося населения. Крестьяне выжженных слобод и других окрестных селений вместе с женами и детьми искали спасения в стенах монастыря; отчего произошла здесь великая теснота. Многие крестьяне привезли свои хлебные запасы и пригнали скот, который еще более увеличивал сию тесноту. Но собственно ратных людей было немного: несколько десятков дворян и детей боярских и несколько сотен стрельцов и казаков составляли привычное к оружию ядро гарнизона; а затем вооружены были монастырские слуги и крестьяне, способные к бою. Все монахи, нестарые и неувечные, также взялись за оружие; между ними было немало людей, прежде служивших в войске и, следовательно, опытных в военном деле (подобно Пересвету и Ослябе, монахам-витязям времен святого основателя лавры). Таким образом, все число монастырских ратников приблизительно простиралось до 3000 человек. Их разделили на две части: одна назначена для постоянной охраны стен и башен; а другая должна была производить вылазки и в случае нужды заменять убыль или подкреплять первую. Дворяне и опытные в военном деле иноки поставлены сотенными начальниками или головами над вооруженными слугами и крестьянами. Женщины исполняли разные работы, а в минуты крайней опасности помогали оборонять стены. Последние были снабжены пушками и пищалями, расставленными преимущественно в нижних или подошвенных бойницах. Порох, свинец и разное оружие тоже были припасены в значительном количестве.
Гарнизоном начальствовали, по обычаю, двое воевод: первым или главным был князь Григорий Борисович Долгоруков, еще недавно в качестве путивльского воеводы усердно служивший первому Лжедимитрию, которого, по-видимому, он считал истинным царевичем; а вторым или его товарищем был дворянин Алексей Иванович Голохвастов. Воеводы эти не отличались ни взаимным расположением, ни надежной преданностью царю Василию. Но святое место одушевляло защитников общим религиозным рвением. Архимандрит Иоасаф своими увещаниями сумел еще усилить это рвение; в начале осады он привел к присяге всех ратных людей начиная с воевод и при гробе угодника Сергия заставил их целовать крест на том, что крепко, «без измены», до последней капли крови стоять против врагов отечества и православной веры.
Любопытно, что в стенах лавры мы встречаем также инокинь, в числе которых находились и две представительницы прежних царских семей, а именно: старицу Марфу, бывшую титулярную ливонскую королеву Марью Владимировну, двоюродную племянницу Грозного, и Ольгу (Ксению) Борисовну Годунову. Эти знатные монахини занимали в монастыре особые помещения, окружены были прислужницами и пользовались более обильным содержанием из царских житниц и погребов.
Обложив монастырь, Сапега сначала пытался подействовать на его защитников двумя грамотами: одна убеждала воевод и служилых людей, а другая архимандрита с братией покориться их «прирожденному» государю Дмитрию Ивановичу; его именем обещали всякие милости, грозя в противном случае взять замок силой и предать смерти всех непокорных. Грамоты привез в монастырь боярский сын Безсон Руготин. Воеводы и дворяне учинили совет с архимандритом и братией; после чего написали общий ответ, заключавший в себе презрительный отказ покориться «ложному царю и латыне иноверным».