Окончив Академию со степенью магистра в 1841 году, иеромонах Феофан проходил обычное для ученого монаха административно-педагогическое послушание - был ректором Киево-Софийского Духовного училища, инспектором Новгородской Духовной Семинарии, с 1844 года читал в Петербургской Духовной Академии лекции по нравственному и пастырскому богословию. Эти лекции он показал архимандриту Игнатию (Брянчанинову), который отнесся к ним одобрительно. Курс нравственного богословия, прочитанный в Академии, отец Феофан построил на святоотеческой аскетике. Отредактированные им впоследствии эти лекции составили книгу «Путь ко спасению».
В 1847 году иеромонах Феофан получил назначение в Иерусалим в Русскую Духовную Миссию и провел там, под началом архимандрита Порфирия (Успенского) 7 лет. На Востоке он довел до совершенства значение греческого языка, изучал еврейский и арабский язык, сам много читал святых отцов и занимался переводами с древних рукописей.
Возведенный в сан архимандрита, отец Феофан после возвращения в Россию снова преподавал в Петербургской Академии, был ректором Олонецкой Духовной Семинарии, настоятелем посольской церкви в Константинополе, а с 1857 года - ректором Петербургской Духовной Академии.
В 1859 году совершилась его хиротония в епископа Тамбовского. Во время одной из архипастырских поездок по Тамбовской епархии святитель посетил Вышенскую пустынь, которая понравилась ему и красотой местоположения, и особенно строгостью своего устава. Назначая настоятелем обители игумена Аркадия, Преосвященный на прощанье сказал ему: «Поезжайте, отец игумен, а там, Бог даст, и я к вам приеду». В 1861 году епископ Феофан принял участие в торжествах открытия мощей святителя Тихона Задонского. Это событие оказало благодатное воздействие на его собственную духовную жизнь. Переведенный в 1863 году на Владимирскую кафедру, он уже три года подал, по примеру новоявленного угодника святителя Тихона, прошение об увольнении его на покой в Вышенскую пустынь. Ходатайство его было удовлетворено.
В Вышенской пустыни святитель провел 28 лет. Образ его жизни в обители был крайне строгим. Он ежедневно ходил ко всем службам и за Богослужением стоял благоговейно, тихо, ради собранности ума и сердца в молитве закрывая глава. По воспоминаниям современников, случалось, что после Литургии подносивший ему антидор стоял перед ним минуты две, пока он не открывал глаза и не брал антидор. В алтаре он никогда не произносил праздного слова. Поучений не говорил, но само его служение было живой проповедью для молящихся.
После пасхальных дней 1872 года святитель Феофан уединился в затвор в монастырском флигеле, где принимал лишь настоятеля, духовника и келейника. В своей келлии он устроил и освятил церковь в честь Богоявления Господня, и последние 11 лет своего жития ежедневно служил в ней Божественную литургию. Службу совершал один и молча по служебнику, иногда пел. Келейное правило он порой заменял молитвой Иисусовой. Кроме молитвенного правила, святитель в затворе читал Священное Писание и творение святых отцов, занимался иконописанием и литературно-богословскими трудами. Сам он со смирением говорил о своем затворничестве: «Из моего запора сделали затвор. Ничего тут затворнического нет. Я заперся, чтобы не мешали, но не в видах строжайшего подвижничества, а в видах беспрепятственного книжничества… так выходит, то я книжник и больше ничего».
Епископ Феофан не преувеличивал значение затвора для духовного преуспеяния. «Когда молитва твоя до того укрепится, что все будет держать самого тебя в сердце пред Богом, тогда у тебя и без затвора будет затвор… Этого затвора ищи, - советовал он, - а о том не хлопочи. Можно и при затворенных дверях по миру шататься, или целый мир напустить в свою комнату». Затворнический подвиг открыл святителю глубины человеческой души, став знатоком души, он делился плодами своей богомудрой опытности с другими. В своей уединенной келлии святитель Феофан не прервал письменного общения с миром. Ему писали иноки, религиозно настроенные интеллигенты, простой народ. Для многих христиан, жаждавшие спасения, он стал заочным духовником. Каждый день святитель получал по 20-40 писем. По письму понять душу писавшего, и в ответе сказать самое главное и нужное. Свои письма он впоследствии соединял в сборнике и издавал. Из писем к княгине П. С. Лукомской была составлена одна из его главных книг «Письма о христианской жизни».