Вскоре события приняли новый оборот: папа Юлий II заключил союз с Венецией для борьбы с французскими и имперскими войсками, удерживавшими Ломбардию. В 1511 г., выдвинув броский лозунг «изгнание варваров», он объединил ряд североитальянских городов в Святейшую лигу, куда вошла и Испания. В жестоком сражении под Равенной в апреле 1512 г., одном из самых масштабных в ходе Итальянских войн, войска Святейшей лиги, главную силу которых составляли испанцы, потерпели поражение от французов. Однако Людовик XII не сумел закрепить победу и после перехода на сторону Лиги его союзника – германского императора Максимилиана I – вынужден был оставить Милан и крепости в Ломбардии. Папа Юлий II разрешил испано-швейцарским войскам в награду за успехи занять Флоренцию, сохранявшую нейтралитет, и взять с нее контрибуцию. Флоренция, дабы избежать разграбления, согласилась в марте 1513 г. на сдачу и уплату контрибуции, а также на восстановление власти Медичи, на чем особенно настаивал новый папа – Лев X из рода Медичи. Венеция, видя усиление союза папы Льва X с Испанией, заключила в 1513 г. договор с Францией, которая после провала своей захватнической политики вынашивала планы нового похода в Италию. В итоге первого этапа Итальянских войн после поражения Франции резко возросло влияние Испании. Итальянские государства так и не смогли образовать прочный союз для отпора всем иноземным завоевателям.
Активные военные действия возобновились в 1515 г. Усилиями нового французского короля Франциска I в сентябре этого года возглавляемые им франко-венецианские войска одержали внушительную победу в битве при Мариньяно, еще одном знаменитом сражении Итальянских войн. Франция вновь утвердилась в Милане, а Венеция восстановила свои владения в Северной Италии, утраченные в войне с Камбрейской лигой. Апеннинский полуостров оказался поделенным на четыре сферы влияния: на севере господствовали Венеция и Франция, в Средней Италии – папство, юг был под властью Испании. Положение относительного равновесия сил начало резко меняться в 1519 г., когда испанский король Карл I стал германским императором Карлом V – теперь Испания и Империя выступили против Франции единым фронтом. Давнее соперничество Франции и Священной Римской Империи обострилось: для Франциска I важно было владеть Миланом – стратегическим центром Северной Италии, откуда открывался путь в центральные районы полуострова, а император поставил целью изгнать французов из Италии и установить там свою власть.
Весной 1521 г. Франциск I начал превентивные военные действия против войск Карла V. Война, в которой итальянские государства почти не принимали участия, продолжалась с переменным успехом до февраля 1525 г., когда в битве при Павии – последнем крупном сражении в ходе Итальянских войн – французы потерпели жестокое поражение, а сам король оказался в плену. Позиции Испании, однако, заметно усилились. Измотанные войной, стороны прекратили дальнейшую борьбу. В новой ситуации Венеция выступила с инициативой объединения итальянских государств, ослабленных постоянными военными действиями на полуострове и бесчинствами иноземных захватчиков, с целью изгнания испанцев. Венеция, Папская область, Генуя, Флоренция, Милан для достижения этой цели пошли на союз с Францией, создав в 1526 г. Коньякскую лигу. Однако раздоры среди членов лиги, нерешительность ее военных операций в Ломбардии привели к потере Милана весной 1527 г. Это позволило испано-имперскому войску Карла V двинуться на Рим. Не получая жалованья, оно превращалось в бандитские отряды, грабившие все на своем пути. 6 мая 1527 г. Рим был захвачен, четыре тысячи горожан изрублены алебардами, дома разграблены, многие церкви и античные памятники разрушены. Среди наемников, участвовавших в разграблении Рима (Sacco di Roma), было немало протестантов, с религиозным фанатизмом обрушившихся на ненавистную цитадель католицизма. Папа Климент VII скрылся в замке св. Ангела. В городе, лишенном продовольствия, начался голод. Трагическая судьба Вечного города потрясла всю Италию и побудила Францию активизировать военные действия против Карла V. К лету 1528 г. ей удалось отвоевать значительную часть Неаполитанского королевства. Успех, однако, не был закреплен – во французской армии началась эпидемия чумы. Франция вынуждена была заключить в августе 1529 г. мир в Камбре, по которому Карл V получил титул короля Италии (он был коронован папой в 1530 г.) и владение Неаполитанским королевством. В итоге четвертого периода Итальянских войн (1515–1529), или первого периода их второго этапа, бесспорные преимущества в стране получила империя Габсбургов. Францию решительно отстранили от «итальянского пирога».