Второй флорентийский период в живописи Леонардо оказался очень плодотворным. Именно в это время он написал одну из своих самых известных работ — «Мону Лизу» («Джоконду»). Согласно Джорджо Вазари, Мона Лиза (Лиза Герардини) была третьей женой флорентийского торговца тканями Франческо дель Джокондо, но данное утверждение часто подвергалось сомнениям. К концу XX века уже существовало несколько десятков версий того, кто на самом деле являлся прототипом Моны Лизы. Выдвигалось много предположений: незаконнорожденная дочь одного из герцогов Сфорца, кто-то из любовниц мужчин Медичи, неизвестная натурщица, юный возлюбленный Леонардо, переодетый женщиной, или сам художник. В 2005 году исследователи из Гейдельбергского университета обнаружили заметки в одном из фолиантов, принадлежащих флорентийскому чиновнику — современнику Леонардо. В частности, в них упоминается да Винчи, о котором говорилось, что он пишет три картины, в том числе портрет Лизы Герардини. Таким образом, подтвердились слова Вазари о том, что Леонардо создал портрет Моны Лизы по заказу ее мужа, который сделал такой подарок жене в честь рождения второго сына.
Вазари очень подробно и с неподдельным восхищением отзывался о «Джоконде» в «Жизнеописаниях»:
«
Исследователи обращают внимание на ряд неточностей, встречающихся в словах Вазари. Тем не менее они отражают ту восторженность, с которой современники Леонардо принимали «Мону Лизу».
Леонардо создавал «Джоконду», когда его художественное мастерство достигло пика. Женщина нарисована на фоне необычного пейзажа, словно увиденного через призму воды, подчеркивающего ее нежный образ. Изображение словно окутано дымкой, создающей эффект воздушности и легкости. Особенностью «Моны Лизы» является фотографическая передача мельчайших деталей: влажные блестящие глаза, бархатные ресницы, кажущиеся настоящими нос и губы, пульс, трепещущий в ложбинке на шее. В изображении нет ни одной прямой линии или угла — все элементы плавно переходят друг в друга. Лицо кажется потрясающе живым. При взгляде на него возникает ощущение, что в любой момент женщина может засмеяться или заговорить со зрителем. Взгляд буквально приковывается к портрету, хочется разглядывать его снова и снова.