Об улыбке Джоконды Зигмунд Фрейд писал: «Кто представляет картины Леонардо, у того всплывает воспоминание о странной, пленительной и загадочной улыбке, затаившейся на губах его женских образов. Улыбка, застывшая на вытянутых, трепетных губах, стала характерной для него и чаще всего называется „леонардовской“. В своеобразно прекрасном облике флорентийки Моны Лизы дель Джоконды она сильнее всего захватывает и повергает в замешательство зрителя. Эта улыбка требовала одного толкования, а нашла самые разнообразные, из которых ни одно не удовлетворяет. <…> Догадка, что в улыбке Моны Лизы соединились два различных элемента, рождалась у многих критиков. Поэтому в выражении лица прекрасной флорентийки они усматривали самое совершенное изображение антагонизма, управляющего любовной жизнью женщины, сдержанности и обольщения, жертвенной нежности и безоглядно-требовательной чувственности, поглощающей мужчину как нечто постороннее. <…> Леонардо в лице Моны Лизы удалось воспроизвести двоякий смысл ее улыбки, обещание безграничной нежности и зловещей угрозы».
Считается, что подобного эффекта Леонардо достиг за счет использования приема сфумато, которым он в совершенстве овладел ко времени написания картины. В 2010 году группа ученых под руководством Филиппа Уолтера провела рентгенологический анализ «Моны Лизы» и получила невероятный результат: выяснилось, что на портрете нет следов мазков кистью или пальцами. Леонардо писал ее слоями, толщина которых не превышала 0,002 мм, то есть 2 мкм. Общая толщина слоев, нанесенных на полотно, составляет всего 30–40 мкм.
Наибольшее восхищение на протяжении нескольких веков вызывает улыбка Моны Лизы, а точнее, намек на нее. Как писал в 1934 году известный советский искусствовед В. Н. Лазарев в монографии «Жизнь и творчество Леонардо да Винчи», «тысячу раз прав был тот художественный критик, который указал на бесполезность расшифровки этой улыбки. Ее сущность заключается в том, что здесь дается одна из первых в итальянском искусстве попыток изобразить естественное психическое состояние ради него самого, как самоцель, без каких-либо привходящих религиозно-этических мотивировок. Тем самым Леонардо сумел настолько оживить свою модель, что в сравнении с ней все более старые портреты кажутся как бы застывшими мумиями
».Для того чтобы добиться живости лица, Леонардо использовал не только художественные приемы. Он старался поддерживать веселое настроение модели, не давая ей скучать. По свидетельству Вазари, художник сам рассказывал ей сказки, а также «держал людей, которые играли на лире или пели, и тут постоянно были шуты, поддерживавшие в ней веселость и удалявшие меланхолию, которую обычно сообщает живопись выполняемым портретам. У Леонардо же в этом произведении улыбка дана столь приятной, что кажется, будто бы созерцаешь скорее божественное, нежели человеческое существо…
».Работая над «Моной Лизой», Леонардо по-прежнему пытался экспериментировать с используемыми красками. И хотя портрет разрушается не так быстро, как фрески, со временем он значительно потемнел, однако, несмотря на это, он является одной из самых знаменитых картин западноевропейского искусства.